陳福輝 ，程慧健 ，楊夢 ，潘歡弘 ，熊長輝 ，鄭翰

(1、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌330029；2、中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 昌平102206)

豬鏈球菌屬于鏈球菌屬R群，是一種人畜共患病病原體。自1968年丹麥?zhǔn)状螆?bào)道人感染豬鏈球菌以來，曾在中國香港、荷蘭、德國、加拿大、瑞典、法國等地也出現(xiàn)過豬鏈球菌感染人的病例，該病發(fā)病呈世界性分布[1]。據(jù)有關(guān)報(bào)道[2]：我國1998年和2005年分別在江蘇四川發(fā)生了大規(guī)模的血清2型豬鏈球菌感染人暴發(fā)，病死率分別高達(dá)56%和19%。還有研究發(fā)現(xiàn)一些非疫區(qū)豬鏈球菌的檢出率很高[3-6]。表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的現(xiàn)狀對豬的養(yǎng)殖、屠宰、加工、銷售等環(huán)節(jié)的從業(yè)人員構(gòu)成了潛在的威脅，為了解和掌握江西省表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的狀況，為探索豬鏈球菌病更有效的預(yù)防和控制策略及方法，2011年至2012年，在曾經(jīng)發(fā)生過豬鏈球菌感染人的景德鎮(zhèn)市和崇仁縣開展了豬攜帶豬鏈球菌的狀況調(diào)查?，F(xiàn)將調(diào)查結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地點(diǎn)及對象 選擇發(fā)生過豬鏈球菌感染人的景德鎮(zhèn)市和崇仁縣的一些屠宰場的表觀健康豬群以及周圍散養(yǎng)戶的表觀健康豬群。

1.2 調(diào)查內(nèi)容 使用自制的無菌鋼絲棉拭子伸入豬咽喉部進(jìn)行涂抹采集屠宰場的來源信息清楚的表觀健康豬群和散養(yǎng)戶的表觀健康豬群的鼻咽拭子，同時(shí)立即采集屠宰后生豬的扁桃體，進(jìn)行豬鏈球菌病原分離鑒定。

1.3 主要試劑與儀器 DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司(Takara)，2×Taq MasterMix購自康為世紀(jì)公司，Wizard Genomic DNA Purification Kit購自美國Promega公司，Lysozyme購自北京博奧拓科技有限公司，THB培養(yǎng)基購自美國BD公司，PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，呋喃妥因購自生工生物工程(上海)有限公司，多粘菌素B購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，氨曲南購自南京都萊生物技術(shù)有限公司，胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司，PCR儀(SensoQuest Labcycler)購自德國Senso公司，凝膠成像系統(tǒng)(GEL Doc2000)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 檢測方法 豬鏈球菌液體選擇性培養(yǎng)基為以THB固體粉末配置的濃度為30mg/ml的液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后平衡至室溫，按指定濃度加入下列成分：呋喃妥因 15μg/ml，氨曲南 50μg/ml，多粘菌素 B 10μg/ml，胎牛血清(FBS)37.5μl/ml。 將采集后的豬鼻咽拭子放入上述肉湯中，置37℃，5%CO2增菌18h，挑適量增菌液劃線接種于StS平板[7]，培養(yǎng)24h后挑選可疑菌落接種于血平板，分純培養(yǎng)18h后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行豬鏈球菌種基因(16s rRNA)及三種毒力基因PCR鑒定[8](表1)，豬鏈球菌種基因(16s rRNA)的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，25 個(gè)循環(huán)， 最后延伸 72℃5min；豬鏈球菌溶菌酶釋放相關(guān)蛋白編碼基因(mrp)的反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，25個(gè)循環(huán)， 最后延伸 72℃5min；溶血素基因(sly)的反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，94℃30s，51℃60s，72℃90s，30 個(gè)循環(huán)， 最后延伸 72℃5min；細(xì)胞外蛋白因子編碼基因 (ef)的反應(yīng)條件94℃預(yù)變性 5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，30 個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃5min。最后挑豬鏈球菌種基因(16s rRNA)陽性菌株做血清玻片凝集試驗(yàn)，即取一滴診斷血清于玻片上，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落與玻片上的診斷血清充分混合，靜止1min，觀察凝集反應(yīng)情況，同時(shí)用生理鹽水作陰性對照。

2 結(jié)果

本次調(diào)查中，共采集到301份表觀健康豬的鼻拭子和扁桃體樣本，通過豬鏈球菌病原分離后，經(jīng)豬鏈球菌種基因(16s rRNA)PCR鑒定，檢出2株豬鏈球菌(見圖1)，經(jīng)血清分型為豬鏈球菌2型，經(jīng)PCR檢測，其毒力基因mrp、sly、ef均為陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，本次調(diào)查中表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的帶菌率為0.66%。

3 討論

注：圖中泳道 1：marker；2-9：菌株；10：陰性對照；11：陽性對照

人感染豬鏈球菌病多數(shù)是由于人直接接觸攜帶豬鏈球菌或病死的豬而引發(fā)感染的，而重癥病例多數(shù)則是由于感染了血清2型豬鏈球菌所致，其臨床表現(xiàn)主要為菌血癥、中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎、肌炎等，并且預(yù)后較差。近十余年來，歐美一些國家及我國的江蘇、四川等地區(qū)相繼報(bào)道過生豬屠宰人員、生肉加工人員發(fā)生感染血清2型豬鏈球菌的重癥病例。江西省2005年、2006年均在景德鎮(zhèn)市、崇仁縣接觸病死豬的人群中也出現(xiàn)過人感染豬鏈球菌的病例，但經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)他們接觸的病死豬均來自外地[9]。而隨后幾年，江西省境內(nèi)再未出現(xiàn)人感染豬鏈球菌的病例，是我省豬攜帶豬鏈球菌水平下降還是豬鏈球菌攜帶的毒力基因水平降低或其他原因所致，尚不清楚，其原因有待進(jìn)一步研究探討。目前檢測豬鏈球菌的傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定檢測方法的檢測時(shí)間較長，大約需要2～3d，不利于急性發(fā)病患者的及時(shí)診療，而近年來，隨著分子生物學(xué)檢測方法的引入應(yīng)用，大大縮短了檢測時(shí)間，但此方法得不到藥敏試驗(yàn)、毒力檢測、分子溯源等所需要的菌株，因此，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)與分子生物學(xué)檢測。

從本次調(diào)查結(jié)果來看，調(diào)查地點(diǎn)的表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的帶菌率僅為0.66%，而據(jù)江蘇省獸醫(yī)研究所報(bào)告，正常豬群中血清2型豬鏈球菌的帶菌率平均為42.6%[10]。新西蘭和澳大利亞的研究表明健康生豬攜帶豬鏈球菌的帶菌率為75%[11]。2009年中國人獸共患病學(xué)學(xué)報(bào)報(bào)道，從我國20個(gè)不同地區(qū)屠宰場采集248份豬扁桃體樣本中，檢測出14株豬鏈球菌，帶菌率為5.65%[12]。貴州省2006-2011年間6年的宿主動(dòng)物監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示[13]：3969份表觀健康豬群鼻拭子和扁桃體樣本中未檢出豬鏈球菌。綜合上述報(bào)道數(shù)據(jù)比較分析，本次調(diào)查中我省兩個(gè)調(diào)查地點(diǎn)的表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的帶菌率較低，其原因可能與采集的樣本數(shù)量較少(301份)以及調(diào)查的地點(diǎn)選取數(shù)量較少僅為2個(gè)有關(guān)，這有待今后研究中進(jìn)一步擴(kuò)大調(diào)查范圍，增加樣本采集數(shù)量。有關(guān)文獻(xiàn)顯示[14]:我國不同地區(qū)的337份健康豬咽拭子標(biāo)本，進(jìn)行16SrRNA、gapdh基因PCR檢測，其檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且其病原分離率亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而我省本次調(diào)查中表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的帶菌率僅為0.66%，是否存在地區(qū)差異，這也有待進(jìn)一步研究。

豬鏈球菌感染是動(dòng)物二類傳染病，目前還沒有證據(jù)證明可以人傳人，人感染豬鏈球菌病是直接接觸感染[15]。我省2005-2006年間發(fā)生的人感染豬鏈球菌病例均由于接觸病死豬而引起感染，因此，應(yīng)該繼續(xù)加強(qiáng)對表觀健康豬攜帶豬鏈球菌的監(jiān)測，同時(shí)重點(diǎn)突出對表觀不健康豬和病死豬的監(jiān)測與管理，以及加強(qiáng)生豬養(yǎng)殖、屠宰、販賣、銷售、加工等各環(huán)節(jié)相關(guān)從業(yè)人員的個(gè)人防護(hù)和健康教育，這些措施將對豬鏈球菌病有效防控起著重要作用。

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