陳瑋琦,郭玉蓉,張 娟,竇 姣,張曉瑞

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

蘋果幼果中酚類物質(zhì)抗氧化活性研究

陳瑋琦,郭玉蓉*,張 娟,竇 姣,張曉瑞

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

蘋果幼果,多酚,抗氧化性

蘋果為我國產(chǎn)量最大的水果,占全球蘋果總產(chǎn)量6000萬t的40%,資源十分豐富。而我國目前的蘋果加工企業(yè)主要集中于蘋果濃縮汁等半成品的生產(chǎn),產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一,附加值低,嚴(yán)重影響著我國蘋果加工業(yè)的發(fā)展[1-2]。因此,充分利用蘋果生長周期過程中的各類有效資源,研究開發(fā)新的蘋果深加工產(chǎn)品已成為當(dāng)務(wù)之急。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果幼果采摘自陜西禮泉。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical 2,2-Diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(1,3,5-tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine,TPTZ)、福林酚 美國Sigma公司;沒食子酸 中國藥品生物制品檢定所;鄰二氮菲、鄰苯三酚 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。所用試劑均為分析純。

7200可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Ar2140型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 新鮮蘋果幼果,實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行打漿處理,現(xiàn)制現(xiàn)用。

1.2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用Folin-ciocalteu法[10]。精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.110±0.001g,溶解定容至100mL容量瓶中,備用。吸取上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL分別置于50mL容量瓶中,定容至刻度,即得濃度分別為10、20、30、40、50μg/mL的沒食子酸工作液。準(zhǔn)確吸取1mL上述不同濃度工作液,加入5mL 10%福林酚,充分反應(yīng),靜置8min后加入4mL 7.5%Na2CO3溶液,混勻后于常溫下置于暗處反應(yīng)2h,以蒸餾水調(diào)零,在765nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程為:y=0.011x+0.1068，R2=0.9996。

1.2.3 蘋果幼果多酚的提取及含量測定 準(zhǔn)確稱取切碎勻漿后的新鮮蘋果幼果10.00g,在55℃條件下用100mL 70%乙醇超聲波輔助提取30min,過濾,重復(fù)提取3次,合并濾液,減壓濃縮除去乙醇,并用X-5大孔樹脂進(jìn)行純化,除去乙醇后真空冷凍干燥得多酚樣品。然后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作,重復(fù)測定吸光度3次,帶入回歸方程,計(jì)算蘋果幼果中多酚含量。

1.2.4 蘋果幼果多酚抗氧化活性的測定

1.2.4.1 FRAP法[11-13]測定蘋果幼果多酚總還原力 物質(zhì)的還原能力與其總抗氧化能力呈顯著正相關(guān)。蘋果幼果多酚總還原力的測定采用Benzie[14]等建立的Ferric Reducing Ability of Plasma(FRAP)法測定其總抗氧化活性大小。Fe3+吡啶三吖嗪可被樣品中還原物質(zhì)還原為二價(jià)鐵形式,使溶液呈現(xiàn)明顯藍(lán)色,于593nm處有最大吸收光,根據(jù)吸光度的大小評價(jià)樣品總抗氧化活性/還原能力的強(qiáng)弱。配制TPTZ工作液參考文獻(xiàn)[14]。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:準(zhǔn)確量取0.5mL不同濃度的FeSO4溶液,分別加入1.5mL蒸餾水和3mL TPTZ工作液,充分混勻后于37℃反應(yīng)0.5h,后于593nm處測定吸光度。以FeSO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘋果幼果多酚總抗氧化活性測定:按照繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作,測定吸光度值大小,重復(fù)測定3次,根據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度值,計(jì)算FeSO4當(dāng)量濃度(mg/L)。FRAP值越大,即FeSO4當(dāng)量濃度越大,蘋果幼果多酚抗氧化活性越強(qiáng)。

1.2.4.2 蘋果幼果多酚對DPPH·清除作用 DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,其甲醇溶液呈紫色,在517nm處有強(qiáng)吸收光。實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測定加入幼果多酚提取液后樣品吸光度值的變化,以此表示其對DPPH·清除能力,結(jié)果以對DPPH·清除率表示,清除率越大,則抗氧化性越強(qiáng)[15-16]。操作如下:向裝有0.5mL不同濃度梯度的樣品甲醇溶液中加入4.5mL DPPH甲醇溶液(0.025mg/mL),搖勻,暗處室溫放置30min,于517nm處測定吸光度的變化。每個樣品重復(fù)3次。清除率按下式計(jì)算:

SA(%)=[1-(Ai-Aj)]/A0×100

式中:SA表示對DPPH·的清除率,%;Ai表示幼果多酚和DPPH甲醇溶液混合液的吸光度;Aj表示未加DPPH溶液的幼果多酚溶液的吸光度;A0表示未加樣品時(shí)DPPH甲醇溶液的吸光度。

具體操作方法:準(zhǔn)確量取4.5mL 0.05mol/L,pH8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中,于25℃水浴中預(yù)熱20min,加入供試樣品液1mL,2.5mmol/L鄰苯三酚0.4mL,充分混勻后在25℃水浴中反應(yīng)5min,立即用兩滴10mol/L HCI終止反應(yīng),蒸餾水調(diào)零,于325nm處測定吸光度,得A1?？瞻讓φ战M以0.1mL蒸餾水代替樣品,得A0,同時(shí)作空白A2,并按下式計(jì)算清除率:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

1.2.4.4 蘋果幼果多酚對羥基自由基(·OH)的清除作用 采用金鳴[18]等建立的以自由基氧化作用為基礎(chǔ)的比色法測定。Fenton反應(yīng)可使H2O2/Fe2+產(chǎn)生·OH,·OH可使鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+,使其在536mn處的強(qiáng)吸收消失。根據(jù)吸光度的減弱判斷樣品清除·OH的能力。量取5.0mL PBS(0.2mol/L)和5.0mL蒸餾水于試管中,作空白參比;量取5.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲、1.0mL FeSO4、2.0mL蒸餾水和1.0mL H2O2(0.01%)于試管中,作損傷;量取5.0mL PBS(0.2mol/L)、1.0mL鄰二氮菲(0.75mmol/L)、1.0mL FeSO4(0.75mmol/L)和3.0mL蒸餾水于試管中作未損傷;量取5.0mL PBS、2.0mL樣品液和3.0mL蒸餾水于試管中,作樣品參比;精密量取5.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲、1.0mL FeSO4、2.0mL樣品液和1.0mL H2O2(0.01%)于試管中。將上述試管同時(shí)置于37℃水浴中反應(yīng)60min,于536nm處測定吸光值,即得A空白、A未損傷、A損傷、A樣參和A樣品,每個樣品重復(fù)測定3次。按下式計(jì)算·OH清除率:

·OH清除率(%)=[(A樣品-A樣參)-(A損傷-A空白)]/(A未損傷-A空參)

蘋果幼果多酚抗氧化性實(shí)驗(yàn)均選用VC和BHT為陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用“SPSS 13.0”統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Excel軟件制表繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果幼果中多酚含量的測定

按照1.2.3所述實(shí)驗(yàn)方法測定蘋果幼果中多酚含量為22.67mg/g。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 蘋果幼果多酚抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 FRAP法測定蘋果幼果多酚總抗氧化能力 采用1.2.4.1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為:y=3.8165x+0.0254，R2=0.9989,結(jié)果如圖2。

圖2 還原力測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of reductive power

采用FRAP法測定不同濃度梯度蘋果幼果多酚粗提物的總還原能力,結(jié)果如圖3所示,從圖中可以看出:在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),隨著蘋果幼果多酚濃度的增加,FeSO4當(dāng)量濃度也在不斷增加,即表明受試物總抗氧化能力不斷增強(qiáng)。幼果多酚濃度與總還原能力總體呈正相關(guān)。與陽性對照BHT相比,不同濃度蘋果幼果多酚提取物FRAP值均比其高,抗氧化能力優(yōu)于BHT,且均達(dá)顯著水平(p<0.05),但二者FeSO4當(dāng)量濃度均低于相應(yīng)濃度陽性對照VC,且差異顯著(p<0.05)?？梢?蘋果幼果多酚提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的總抗氧化能力。

圖3 FRAP法測定不同濃度多酚的還原力Fig.3 Reductive power of polyphenols for different concentrations by the method of FRAP

2.2.2 不同濃度蘋果幼果多酚對DPPH·的清除作用 DPPH·分析法被廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究,它是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,實(shí)驗(yàn)體系中存在自由基清除劑時(shí),可與DPPH·單電子配對而使其特征吸收峰消失或減弱,表現(xiàn)為吸光度的增大或減小,以此評價(jià)受試物的體外自由基清除能力。采用DPPH法測定不同濃度梯度蘋果幼果多酚提取物對DPPH·清除作用,結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知,幼果多酚提取物,VC,BHT對DPPH·均有較強(qiáng)的清除作用,且隨樣品濃度的增加而不斷增強(qiáng)。當(dāng)濃度小于30μg/mL時(shí),VC對DPPH·的清除效果優(yōu)于幼果多酚提取物和BHT,且差異顯著(p<0.05)。當(dāng)濃度大于50μg/mL時(shí),VC和幼果多酚提取物的清除效果相接近,清除效果強(qiáng)。當(dāng)濃度為90μg/mL時(shí),幼果多酚提取物和VC的清除率分別為96.96%和97.42%,均已接近最大清除率。

圖4 不同濃度蘋果幼果多酚對DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on DPPH·

圖5 不同濃度蘋果幼果多酚對·的清除作用Fig.5 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on ·

2.2.4 不同濃度蘋果幼果多酚對·OH的清除作用 實(shí)驗(yàn)采用鄰二氮菲-Fe3+-H2O2法評價(jià)不同濃度梯度蘋果幼果多酚清除·OH的能力,以此反映幼果多酚抗氧化性的強(qiáng)弱。結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同濃度蘋果幼果多酚對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effects of polyphenols for different concentrations in unripe apple on ·OH

羥基自由基(·OH)是需氧生物代謝過程中產(chǎn)生的具有強(qiáng)氧化能力的氧自由基,它被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的活性氧自由基,其反應(yīng)性極強(qiáng),壽命極短,對機(jī)體的破壞作用最大,是造成生物有機(jī)體過氧化損傷的主要因素。由圖5可知,無論是幼果多酚受試物還是陽性對照,三者對·OH均有較強(qiáng)的清除作用,且隨濃度的增加,其清除作用增強(qiáng)。當(dāng)蘋果幼果多酚濃度為90μg/mL時(shí),其對·OH的清除率可高達(dá)82.20%,當(dāng)實(shí)驗(yàn)濃度大于30μg/mL時(shí),三者對·OH的清除效果強(qiáng)弱順序?yàn)?VC>蘋果幼果多酚>BHT,且差異顯著(p<0.05)。

2.3 相關(guān)性分析

對蘋果幼果多酚含量與其抗氧化性作相關(guān)性分析,結(jié)果如表1所示。

表1 蘋果幼果多酚與其抗氧化性的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between polyphenol contents and antioxidant activity of unripe apple products

注:* 相關(guān)性顯著(p<0.05),** 相關(guān)性極顯著(p<0.01)。

3 結(jié)論

[1]呂霜竹,霍學(xué)喜.中國蘋果出口歐盟市場價(jià)格競爭力研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):社會科學(xué)版,2013(4):56-61.

[2]苗洪亮.中國蘋果及果汁出口的市場環(huán)境分析及對策研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006:1-60.

[3]Lijun Sun,Yurong Guo,Chengcheng Fu,etal. Simultaneous separation and purifycation of total polyphenols,chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples[J]. Food Chemistry,2013,136(2):1022-1029.

[4]唐傳核,彭志英. 蘋果多酚的開發(fā)與應(yīng)用[J].中國食品添加劑,2001(2):41-44.

[5]Yinrong L,Yeap F L. Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace[J]. Food Chemistry,2000,68(1):81-85.

[6]Suarez B,Alvarez A L,Garcia Y D,etal. Phenolic profiles,antioxidant activity and in vitro antiviral properties of apple pomace[J]. Food Chemistry,2010,120(1):339-342.

[7]Yanggaida A,Kanda T,Tanabe M,etal. Inhibitory effects of apple polyphenols and related compounds on cariogenic factors of mutans streptococci[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(11):5666-5671.

[8]陳瑩,徐抗震,聶威,等. 蘋果生果中蘋果多酚提取工藝的優(yōu)化研究[J].應(yīng)用化學(xué),2009,38(11):1582-1585.

[9]艾志錄,郭娟,王育紅,等. 微波輔助提取蘋果渣中蘋果多酚的工藝研[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2006,22(6):188-191.

[10]高曉明,呂磊,王瑞,等. 蘋果多酚的乙醇提取和大孔樹脂純化工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(11):21-25.

[11]牛鵬飛,仇農(nóng)學(xué),杜寅. 蘋果渣中不同極性多酚的分離及體外抗氧化活性研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(3):238-242.

[12]李志西,李元瑞,葛蕾,等. 蘋果渣多酚超聲波提取工藝及其抗氧化性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,33(8):131-134.

[13]Spigno G,Tramelli L,Faveri M D D. Effects of extraction time,temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics[J]. Journal of Food Engineering,2007,81:200-208.

[14]Benzie I F F,Strain J J. The ferric reducing ability of plasma as a measure of “antioxidant power”:the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry,1996,239:70-76.

[15]Akowuah G A,Ismail Z,Norhayati I,etal. The effects of different extraction solvents of varying polarities on polyphenols of Orthosiphon stamineus and evaluation of the free radical-scavenging activity[J]. Food Chemistry,2005,93:311-317.

[16]仇農(nóng)學(xué),王宏,李艷,等. 蘋果渣中多酚物質(zhì)的體外抗氧化活性[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào),2006,23(5):527-531.

[17]吳青,黃娟,羅蘭欣,等. 5種中草藥提取物抗氧化活性的研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2006,6(1):284-288.

[18]Larrauri J A,Sanchez-Moreno C,Saura-Calixto F. Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(7):2694-2697.

Antioxidative activitiesinvitroof polyphenols from unripe apple pomace

CHEN Wei-qi,GUO Yu-rong*,ZHANG Juan,DOU Jiao,ZHANG Xiao-rui

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China)

unripe apple;polyphenols;antioxidant properties

2014-03-26

陳瑋琦(1989-)，女，碩士研究生，主要從事食品功能成分開發(fā)及利用方面的研究。

*通訊作者:郭玉蓉(1962-)，女，博士，教授，主要從事食品生物加工研究。

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金資助(CARS-28)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)01-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.016