馬曉珂,王振斌,朱夢昕,林曉明,王 林,王 干

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

蛋白酶法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的工藝研究

馬曉珂,王振斌*,朱夢昕,林曉明,王 林,王 干

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

以脫脂后的芝麻餅粕為原料,采用酶法提取法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過正交實驗確定蛋白酶法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)最佳工藝條件為:酶解時間45min,pH9,酶解溫度50℃,加酶量4000U/g,液料比20∶1。在此最佳條件下,芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率為80.12%。所得產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量為67.89%。

蛋白酶法,芝麻餅粕,蛋白質(zhì),提取

我國芝麻餅粕資源豐富[1],且芝麻餅粕蛋白質(zhì)氨基酸組成合理,是一種很好的蛋白質(zhì)資源[2]。分離制備植物蛋白質(zhì)的方法多種多樣,例如堿溶酸沉法、酶解法、反膠束法、膜分離法等[2-3],目前國內(nèi)外研究蛋白質(zhì)提取的方法主要為堿提法和酶解法兩種。堿提法具有操作簡單、易于控制、成本低廉等優(yōu)點,但強堿易產(chǎn)生賴氨酰丙氨酸這些有毒物質(zhì),引起營養(yǎng)物質(zhì)的損失,同時還會使蛋白質(zhì)變性和水解,增強了美拉德反應(yīng),影響產(chǎn)品色澤,造成蛋白質(zhì)商用品質(zhì)降低[4]。用蛋白酶法提取蛋白質(zhì),反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少,不破壞氨基酸,且不污染環(huán)境,對蛋白質(zhì)有改性作用,蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解有助于拓寬蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍[5]；酶能使蛋白質(zhì)水解成肽和氨基酸,易于腸道消化吸收,同時能提高和改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性、黏度[1]；酶法水解能避免酸法水解或堿法水解對氨基酸的破壞作用和變旋作用[6],以保證蛋白質(zhì)質(zhì)量。

芝麻蛋白質(zhì)主要是堿溶性蛋白質(zhì),約占67%,因此采用堿性蛋白酶進行酶解[7]。本研究以芝麻餅粕為原料,采用堿性蛋白酶水解法提取蛋白質(zhì),確定蛋白酶提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù),以期為芝麻餅粕蛋白質(zhì)的深加工利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

芝麻餅粕 由新沂吉順昌油脂科技有限公司提供,測得其中粗蛋白質(zhì)35.99%,粗脂肪15.28%,水分8.48%,灰分9.96%,其他成分35.61%。

堿性蛋白酶 購于無錫杰能科生物工程有限公司,根據(jù)Folin-酚法(SB/T 10317-1999)計算出酶活為140.532U；分析純試劑:氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀 購于國藥集團化學(xué)試劑公司。

Fz-4藥物粉碎機 溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠；pH5-3C型pH計 上海理達儀器廠；HH-A恒溫水浴攪拌鍋 江蘇金壇市中大儀器廠；SPF401F電子天平 奧豪斯國際貿(mào)易(上海)中國有限公司；TGL-16高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；FOSS 2100型凱氏定氮裝置 上海新嘉電子有限公司。

1.2 蛋白酶法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的工藝

稱取粉碎過80目篩的芝麻餅粕粉若干克,加入100mL的去離子水配成相應(yīng)濃度的溶液,調(diào)節(jié)pH至一定值,調(diào)節(jié)溫度后加入一定量的堿性蛋白酶。反應(yīng)過程中經(jīng)常以1mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH,反應(yīng)結(jié)束后,100℃滅酶15min,冷卻后4500r/min離心20min,下層沉淀再加5倍體積去離子水?dāng)嚢?0min后離心,合并三次上清液,真空濃縮、冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品[8]。測定其蛋白質(zhì)含量,并計算蛋白質(zhì)提取率。

1.3 蛋白酶法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的單因素設(shè)計

在堿性蛋白酶酶解芝麻餅粕的過程中,分別研究酶解時間(15、30、45、60、75、90min)、pH(7、8、9、10、11)、酶解溫度(30、40、50、60、70℃)、加酶量(1000、2000、3000、4000、5000U/g芝麻粕)及液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1mL/g)對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.4 蛋白酶法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取酶解時間、pH、酶解溫度、加酶量為因素,采用正交實驗的方法,進行四因素三水平設(shè)計(見表1)。通過對實驗數(shù)據(jù)的分析,得出最優(yōu)參數(shù)。

表1 正交實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

1.5 蛋白質(zhì)提取率和蛋白質(zhì)得率的計算

采用半微量凱式定氮法測定蛋白質(zhì)含量,用式(1)計算芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率:

式(1)

1.6 基本化學(xué)成分的測定

粗蛋白質(zhì)測定:凱氏定氮法(GB5009.5-2003)；

粗脂肪測定:索氏抽提法(GB5009.6-2003)；

水分測定:恒重法(GB5009.3-2003)；

灰分測定:高溫灼燒法(GB5009.4-2003)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶水解提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的單因素實驗

2.1.1 酶解時間對堿性蛋白酶提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的影響 在液料比20∶1,酶解pH9、加酶量3000U/g、酶解溫度50℃條件下,考察酶解時間對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響,結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知,芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率隨著時間的增加而升高。當(dāng)酶解時間為30min時蛋白質(zhì)提取率達到76.56%,此后隨著酶解時間的繼續(xù)增大芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率增加緩慢。分析原因認(rèn)為堿性蛋白酶在反應(yīng)初期酶活力較高,能夠和蛋白質(zhì)完全作用,而且不存在產(chǎn)物抑制作用；隨著時間的延長,酶構(gòu)象發(fā)生改變,酶活力逐漸下降,同時水解物中產(chǎn)生了抑制酶促反應(yīng)的產(chǎn)物,因此蛋白質(zhì)提取率的增加變得緩慢。綜合考慮能耗和效率,所以選取酶解時間30min作進一步優(yōu)化。

圖1 酶解時間對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on extraction rate of sesame cake protein注:標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(p<0.05), 而標(biāo)有相同字母者表示組間差異不顯著(p>0.05),以下類同。

2.1.2 pH對堿性蛋白酶提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的影響 在液料比20∶1、加酶量3000U/g、酶解溫度50℃、酶解時間30min條件下,考察pH對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of pH value on extraction rate of sesame cake protein

由圖2可知,pH對堿性蛋白酶提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的影響顯著(p<0.05)。在pH7～11范圍內(nèi)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率隨pH的增加先上升后下降,其中在pH9時蛋白質(zhì)提取率最高,為76.56%。這是因為堿性蛋白酶的最適pH為9,超出這個范圍,酶的活性降低,提取率下降。pH影響酶活力的原因主要有3個方面:過酸或過堿使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞,引起酶構(gòu)象的改變,導(dǎo)致酶活性喪失；當(dāng)pH改變不很劇烈時,酶雖然未變性,但pH可影響底物的解離狀態(tài)、影響酶分子活性部位上有關(guān)基團的解離,從而影響與底物的結(jié)合或催化;pH影響維持酶分子空間結(jié)構(gòu)的有關(guān)基團解離,從而影響了酶活性部位的構(gòu)象,進而影響酶的活性[8-9]。因此,本實驗選取pH9作進一步優(yōu)化。

2.1.3 酶解溫度對堿性蛋白酶提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的影響 在液料比20∶1、酶解pH9、加酶量3000U/g、酶解時間30min條件下,考察酶解溫度對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響,結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知,酶解溫度對堿性蛋白酶提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的影響顯著(p<0.05)。在溫度30～70℃范圍內(nèi),芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率隨溫度的升高先上升后下降,其中在50℃時蛋白質(zhì)提取率最高。分析原因認(rèn)為酶具有最適溫度,溫度提高會影響酶的穩(wěn)定性和底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的速度。當(dāng)溫度低于最適溫度時,提高溫度能增大酶活力,加快反應(yīng)速率,因此蛋白質(zhì)提取率提高。當(dāng)溫度超過最適溫度后,蛋白質(zhì)提取率降低,可能是因為堿性蛋白酶因受熱出現(xiàn)部分變性,活性逐漸降低[10-11]。因此,選擇50℃作進一步優(yōu)化。

圖3 酶解溫度對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on extraction rate of sesame cake protein

2.1.4 加酶量對堿性蛋白酶提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的影響 在液料比20∶1、酶解pH9、酶解溫度50℃、酶解時間30min條件下,考察酶解溫度對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 加酶量對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of enzyme does on extraction rate of sesame cake protein

由圖4可知,隨著加酶量的增大,芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率不斷增高。在3000U/g之前,蛋白質(zhì)提取率明顯增加,但當(dāng)超過3000U/g 時,蛋白質(zhì)提取率增加緩慢。分析原因認(rèn)為在底物分子過飽和的情況下,底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速率隨著加酶量的增大而增大；當(dāng)加酶量增大到一特定值,所有的底物分子與酶分子已經(jīng)充分結(jié)合,此時繼續(xù)增大加酶量對反應(yīng)速率影響很小,因而蛋白質(zhì)提取率變化很小[12-13]。綜合考慮酶作用的效率與經(jīng)濟成本,選擇加酶量3000U/g作進一步優(yōu)化。

2.1.5 液料比對堿性蛋白酶提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的影響 在酶解pH9、加酶量3000U/g、酶解溫度50℃、酶解時間30min條件下,考察液料比對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響,結(jié)果如圖5所示。

圖5 液料比對芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of solvent/meal ratio on extraction rate of sesame cake protein

由圖5可知,隨著液料比的增大,芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率不斷增大。在液料比20∶1之前蛋白質(zhì)提取率增加較快,但當(dāng)超過20∶1后蛋白質(zhì)提取率增加緩慢。分析原因認(rèn)為當(dāng)液料比較低時,提取體系黏度較大,影響底物分子在溶液中的擴散運動,不利于底物與酶的結(jié)合；隨著液料比的增加,底物分子流動速率增大,促進酶與底物充分接觸,進而提高了蛋白質(zhì)的提取率。繼續(xù)增大液料比,蛋白質(zhì)已經(jīng)幾乎完全溶出,因此提取率增加緩慢,且過大的料液比不利于蛋白質(zhì)提取后的濃縮沉淀。結(jié)合提取的經(jīng)濟性考慮,本實驗選取液料比20∶1作為進一步蛋白質(zhì)的優(yōu)化研究,不再參與優(yōu)化。

2.2 正交實驗優(yōu)化蛋白酶法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的酶解工藝

實驗結(jié)果見表2。

由表2極差分析可知,影響堿性蛋白酶酶解芝麻餅粕制備蛋白質(zhì)的主要因素是pH,其次是酶解時間,再次為酶解溫度,影響最小的為加酶量。影響堿性蛋白酶制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的主次因素順序為:pH(B)>酶解時間(A)>酶解溫度(C)>加酶量(D)。由實驗結(jié)果可知,堿性蛋白酶酶解芝麻餅粕制備蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝組合為A3B2C2D3,即酶解時間45min,pH9,酶解溫度50℃,加酶量4000U/g,液料比20∶1。并對該工藝進行驗證實驗,3次平行實驗芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率分別為80.55%、79.75%、80.06%,其平均提取率80.12%。

表2 正交實驗表 L9(34)及結(jié)果Table 2 Orthogonal test and its results L9(34)

注:正交結(jié)果中的提取率均為三次平行實驗的平均值。

表3 芝麻餅粕蛋白質(zhì)基本成分及含量(%)Table 3 Proximate composition of sesame cake(%)

2.3 蛋白酶法制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)基本成分的測定

根據(jù)正交實驗結(jié)果,選用確定的工藝條件提取芝麻餅粕蛋白質(zhì),將提取的芝麻餅粕蛋白質(zhì)溶液經(jīng)真空濃縮后冷凍干燥得到芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品,測定的基本成分及含量見表3。由表3可知,堿性蛋白酶酶解制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)含量為67.89%。

3 結(jié)論

以芝麻餅粕為原料,采用堿性蛋白酶酶解法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過正交實驗確定最佳工藝條件為:酶解時間45min,pH9,酶解溫度50℃,加酶量4000U/g,液料比為20∶1,蛋白質(zhì)的提取率達到80.12%,所得產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量為67.89%。

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Enzymatic preparation of protein from sesame cake

MA Xiao-ke,WANG Zhen-bin*,ZHU Meng-xin,LIN Xiao-ming,WANG Lin,WANG Gan

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

The technical parameters of protein extracting from industrial sesame cake by means of alkaline proteinase method extraction were established. After single factor tests and orthogonal test,the optimum parameters of alkaline proteinase method were as follows:hydrolysis time 45min,pH9,hydrolysis temperature 50℃,enzyme does 4000U/g,solvent/meal ratio 20∶1,and the extraction rate of sesame cake protein was 80.12%. The content of sesame cake protein was 67.89%.

alkaline proteinase;sesame cake;protein;extraction

2014-05-05

馬曉珂(1974-)，女，碩士，實驗師，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分分離與應(yīng)用。

*通訊作者:王振斌(1975-) ，男，博士，副教授，研究方向: 天然產(chǎn)物分離及應(yīng)用。

江蘇省科技支撐項目(BC2012421)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目; 江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目；江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項資助項目(12A018)。

TS229

B

1002-0306(2015)03-0246-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.043