姚春艷， 姜麗娜， 汪洪濤， 金齊力， 李柏青△

多色流式細胞術(shù)對正常人外周血中TCRVα24＋NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞間的相關(guān)性研究＊

姚春艷1， 姜麗娜2， 汪洪濤1， 金齊力3， 李柏青1△

1蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系免疫學(xué)教研室，安徽省感染與免疫重點實驗室，蚌埠 233000
2蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，蚌埠 233000
3蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科，蚌埠 233000

目的 探討正常人外周血中TCRVα24＋NKT細胞與傳統(tǒng)CD3＋T細胞在含量和亞群上的關(guān)系。方法 采用五色熒光染色和流式細胞術(shù)檢測TCRVα24＋NKT細胞與傳統(tǒng)CD3＋T細胞在30例正常人外周血中所占比例，兩群細胞中各亞群（CD4亞群、CD8亞群、雙陰性亞群及CD45RA初始細胞亞群）在各自細胞群體中所占比例，統(tǒng)計軟件分析兩群細胞間各指標(biāo)的差異及相關(guān)性。結(jié)果 NKT細胞在正常人外周血中所占比例為0.35%（0.10%～1.50%），CD3＋T細胞比例為58.4%（43.2%～72.5%）；在Va24＋NKT細胞中CD4亞群所占比例為69.1%（21.3%～90.9%）、CD8亞群為15.0%（4.5%～76.2%）、雙陰性亞群為9.5%（0.7%～69.4%）、CD45RA初始細胞亞群為32.4%（6.8%～54.0%），在CD3＋T細胞中CD4亞群所占比例為54.7%（27.0%～74.7%）、CD8亞群為33.7%（19.9%～48.2%）、雙陰性亞群為10.2%（1.9%～24.4%）、CD45RA初始細胞亞群為39.8%（10.3%～63.0%）。兩群細胞間除CD4亞群和CD45RA亞群具有顯著相關(guān)性（r＝0.435 5，P＜0.05；r＝0.829 5，P＜0.01），其余各指標(biāo)均無相關(guān)性。CD4＋NKT細胞含量與總NKT細胞含量呈顯著負相關(guān)，而CD8＋NKT與總NKT細胞呈顯著正相關(guān)（r＝－0.680 2，P＜0.01；r＝0.401 7，P＜0.05）。結(jié)論 正常人外周血中TCRVα24＋NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞間除在CD4亞群和CD45RA初始細胞亞群間有顯著相關(guān)外，其余各亞群相關(guān)較少。

流式細胞術(shù)； NKT細胞； 相關(guān)性

自然殺傷T細胞（natural killer T cells，NKT細胞）是一類表達NK細胞相關(guān)表面分子的特殊T淋巴細胞亞群，該群細胞具有以下主要特征:首先，NKT細胞TCR的Vα鏈表達較恒定，在小鼠恒定表達Vα14－Jα18鏈，且通常與Vβ8.2、Vβ2或Vβ7共表達［1］，在人類則恒定表達Vα24－Jα18－Vβ11鏈［2］，因此NKT細胞又被稱為iNKT細胞（invariant NKT cell，iNKT細胞），由于NK細胞通常情況下不表達TCR，所以這也是NKT細胞區(qū)別于NK細胞的主要特點之一；其次，NKT細胞只能識別由CD1d分子提呈的糖脂類抗原，而非傳統(tǒng)T細胞所識別的由MHCⅠ類或Ⅱ類分子提呈的蛋白質(zhì)類抗原［3］，活化后的NKT細胞可以迅速分泌IFN－γ、IL－4、IL－17等細胞因子，從而發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能［4－6］。

NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞間除具有以上區(qū)別外，也存在某種聯(lián)系。如NKT細胞通常被認(rèn)為來源于胸腺［7］，這與傳統(tǒng)T細胞相同；CD4和CD8分子是劃分傳統(tǒng)T細胞的分化發(fā)育階段的標(biāo)志分子，通常根據(jù)CD4和CD8分子的表達情況可以對T細胞進行分類，而NKT細胞也可按此法進行分類，可將NKT細胞劃分為CD4＋、CD8＋和CD4－CD8－雙陰性NKT細胞；此外，研究表明在小鼠體內(nèi)分布有傳統(tǒng)T細胞的各器官或組織內(nèi)都分布著不同數(shù)量的NKT細胞［8］。

為了進一步弄清人體內(nèi)NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞間的關(guān)系，本實驗對正常人外周血中的NKT細胞和傳統(tǒng)T細胞的含量及其各亞群所占比例進行檢測和分析，以期為進一步揭示人體NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞間的關(guān)系提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗所用的正常人外周血細胞均來自蚌埠醫(yī)學(xué)院健康教工和學(xué)生，年齡18～28歲，平均年齡（21 ±3）歲，共30例，其中男性18例，女性12例。

1.2 主要材料、試劑

所用流式熒光抗體如下:FITC標(biāo)記的抗人CD45RA（IgG2b，clone MEM－56），PeCy5.5標(biāo)記的抗人CD4（IgG2a，clone S3.5），APC標(biāo)記的抗人CD8（IgG2a，clone OKT8），APC－AF750標(biāo)記的抗人CD3（IgG2a，clone S4.1）為Caltag公司產(chǎn)品；PE標(biāo)記的抗人TCRVα24（IgG1，clone C15）為Immunotech公司產(chǎn)品。流式細胞儀（FACSAria），購自美國BD公司。

1.3 檢測方法

無菌抽取正常人外周血5mL，肝素抗凝，采用五色熒光染色和流式細胞術(shù)進行檢測。染色時測試管內(nèi)依次加入一定量的流式抗體CD45RA FITC／TCRVα24PE／CD4PeCy5.5／CD8APC／CD3APCAF750，同時加染空白對照管，同型對照管和各熒光補償管，每管加入壓積紅細胞100μL，混勻后室溫避光反應(yīng)20min，各管加1倍溶血劑（BD公司）3 mL，室溫避光反應(yīng)10min后離心棄上清，染色緩沖液洗2次，0.5mL 2%多聚甲醛固定細胞30min后于24h內(nèi)上流式細胞儀獲取數(shù)據(jù)，每管獲取細胞數(shù)設(shè)置為iNKT細胞門內(nèi)500個；采用FACSDiva軟件分析流式數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用GraphPab Prism 5.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以中位數(shù)表示，采用Mann－Whitney test檢驗兩群細胞間的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；采用Pearson相關(guān)性分析分析兩群細胞間的相關(guān)性，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常人外周血中TCRVα24＋NKT細胞含量與傳統(tǒng)T細胞含量的相關(guān)性分析

30例正常人外周血淋巴細胞中CD3＋TCRVα24＋NKT細胞所占比例為0.35%（0.10%～1.50%），CD3＋T細胞比例為58.4%（43.2%～72.5%）。兩種細胞的相對含量間無顯著相關(guān)（r＝0.024 98，P＝0.895 7）。見圖1。

圖1 正常人外周血中NKT細胞與T細胞含量間的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of the frequency between TCRVα24＋NKT cells and conventional T cells in the peripheral blood of normal persons

2.2 正常人外周血中TCRVα24＋NKT細胞各亞群與傳統(tǒng)T細胞各亞群間的相關(guān)性分析

CD4和CD8是劃分T細胞分化發(fā)育階段的標(biāo)志分子，根據(jù)CD4和CD8分子表達情況，可以將T淋巴細胞和NKT細胞分為CD4陽性，CD8陽性，雙陰性（DN）3個亞群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NKT細胞的上述3個亞群所占比例分別為69.1%（21.3%～90.9%）、15.0%（4.5%～76.2%）、9.5%（0.7%～69.4%），而T細胞的3亞群所占比例分別為54.7%（27.0%～74.7%）、33.7%（19.9%～48.2%）、10.2%（1.9%～24.4%）。CD45RA是初始細胞的表面標(biāo)志之一，CD45RA陽性的NKT細胞即初始NKT細胞在正常人外周血中含量為32.4%（6.8%～54.0%），傳統(tǒng)初始T細胞的含量為39.8%（10.3%～63.0%）。分析發(fā)現(xiàn)，正常人NKT細胞中CD4亞群比例顯著高于傳統(tǒng)T細胞中CD4亞群的比例（P＜0.01），而CD8亞群和初始NKT細胞的比例卻顯著低于傳統(tǒng)T細胞相應(yīng)亞群比例（P＜0.01，P＜0.05），NKT細胞的CD4亞群及初始細胞亞群比例與傳統(tǒng)T細胞相應(yīng)亞群間呈顯著正相關(guān)（r＝0.435 5，P＜0.05；r＝0.829 5，P＜0.01），其它各亞群無顯著相關(guān)性。見圖2、3。

圖2 NKT細胞及傳統(tǒng)T細胞中各亞群比較Fig.2 Comparison of the proportion of each subset between NKT cells and conventional T cells

圖3 NKT細胞及傳統(tǒng)T細胞中各亞群間相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of the proportion of each subset between NKT cells and conventional T cells

2.3 TCRVα24＋NKT細胞中CD4／CD8與傳統(tǒng)T細胞CD4／CD8的相關(guān)性分析

CD4／CD8在TCRVα24＋NKT細胞中為4.725（0.28～14.90），顯著高于在CD3＋T細胞中的比值1.60（0.59～3.75）（P＜0.01），但兩者間無顯著相關(guān)性（r＝0.321 1，P＞0.05）。見圖4。

圖4 NKT細胞和傳統(tǒng)T細胞中CD4／CD8比值比較及相關(guān)性分析Fig.4 Comparison of CD4／CD8between NKT cells and conventional T cells and the correlation analysis

2.4 正常人外周血中NKT細胞各亞群含量與NKT細胞含量間及傳統(tǒng)T細胞各亞群含量與T細胞含量間相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在NKT細胞群體中CD4亞群所占比例與總NKT細胞比例之間呈顯著負相關(guān)（r＝－0.680 2，P＜0.01），而CD8亞群所占比例與總NKT細胞比例之間卻呈顯著正相關(guān)（r＝0.401 7，P＜0.05）。而傳統(tǒng)T細胞各亞群與總T細胞之間無顯著相關(guān)性。見圖5。

圖5 NKT細胞和傳統(tǒng)T細胞與其各亞群之間的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between the proportions of NKT cell subsets and NKT cells，and between the proportions of T cell subsets and T cells

3 討論

NKT細胞最初被定義為能夠同時表達NK細胞和T細胞表面標(biāo)志的一類特殊的T淋巴細胞亞群。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在NKT細胞中有一小部分是不表達NK細胞標(biāo)志的，所以Godfrey在定義NKT細胞時則用能夠識別由CD1d分子提呈的糖脂類抗原來取代表達NK細胞表面標(biāo)志［9］?，F(xiàn)在已經(jīng)明確雖然大部分NKT細胞表達NK細胞表面標(biāo)志，如CD161、CD94等，但由于NKT細胞恒定表達TCR，而NK細胞則不表達TCR，再加上NK細胞來源于骨髓，所以NKT細胞與NK細胞是截然不同的兩群細胞。

NKT細胞是傳統(tǒng)T細胞的一類特殊亞群，這兩群細胞間又存在怎樣的區(qū)別和聯(lián)系呢？研究表明NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞間主要區(qū)別在于NKT細胞只能識別由CD1d分子提呈的糖脂類抗原，而非傳統(tǒng)T細胞所識別的由MHCⅠ類或Ⅱ類分子提呈的蛋白質(zhì)類抗原［3］；此外，活化后的NKT細胞可以迅速分泌IFN－γ、IL－4、IL－17等細胞因子，從而發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能［4－6］，是一類重要的固有免疫應(yīng)答細胞。

NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞在發(fā)育器官、亞群分類、體內(nèi)分布等方面也存在某種聯(lián)系，如NKT細胞通常被認(rèn)為來源于胸腺［7］，也可根據(jù)CD4和CD8分子的表達情況進行分類，這些和傳統(tǒng)T細胞完全相同。為了更清楚地認(rèn)識人體外周血中的NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞間是否存在某些聯(lián)系，本研究利用多色流式細胞術(shù)對正常人外周血中的NKT細胞和傳統(tǒng)T細胞的含量及其各亞群所占比例進行了檢測和分析。結(jié)果顯示NKT細胞在正常人外周血淋巴細胞中所占比例較小，為0.35%（0.1%～1.5%），這一結(jié)果與李子濤等［10］的檢測結(jié)果相符，而CD3＋T細胞比例則為58.4%（43.2%～72.5%），經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩群細胞含量無顯著相關(guān)性（圖1）。在對兩群細胞中CD4亞群、CD8亞群、雙陰性亞群比例檢測時發(fā)現(xiàn)，在Va24＋NKT細胞中CD4亞群所占比例為69.1%（21.3%～90.9%）、CD8亞群為15.0%（4.5%～76.2%）、雙陰性亞群為9.5%（0.7%～69.4%），CD4與CD8比值為4.725（0.28～14.90）；而在CD3＋T細胞中CD4亞群所占比例為54.7%（27.0%～74.7%）、CD8亞群為33.7%（19.9%～48.2%）、雙陰性亞群為10.2%（1.9%～24.4%），CD4與CD8比值為1.6（0.59～3.75），檢測結(jié)果與其它報道相符［10－11］。這些數(shù)據(jù)表明在NKT細胞群體中CD4亞群占優(yōu)勢，平均達69.1%，大約是CD8亞群的4.725倍，但個體差異很大。在我們檢測的30例正常人樣本中，發(fā)現(xiàn)有3例樣本的NKT細胞CD8亞群的比例高達61.8%、76.2%和72.8%（圖2），說明在大多數(shù)正常人外周血NKT細胞中以CD4亞群為主，但由于個體差異較大，不排除在個別正常人NKT細胞中則以CD8亞群為主；而在傳統(tǒng)T細胞群體中CD4亞群所占比例略大于CD8亞群比例，比值大約為1.6倍，且個體間差異遠不及NKT細胞（圖4）。相關(guān)性分析顯示兩群細胞中CD4亞群比例顯著相關(guān)，但由于CD8亞群不相關(guān)，所以CD4與CD8比值無顯著相關(guān)性（圖2～4）。研究中還發(fā)現(xiàn)初始NKT細胞與初始傳統(tǒng)T細胞之間呈顯著正相關(guān)（圖2、3）。在對NKT細胞群體進行相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)，CD4亞群NKT細胞比例與總NKT細胞含量之間呈顯著負相關(guān)，這一結(jié)果與其它報道的結(jié)果完全相符［11－12］。同樣方法分析了傳統(tǒng)T細胞，結(jié)果顯示傳統(tǒng)T細胞各亞群與總T細胞之間無顯著相關(guān)（圖5）。

綜上所述，本實驗運用多色流式細胞術(shù)對NKT細胞和傳統(tǒng)T細胞及各自亞群在正常人外周血中的分布規(guī)律進行了檢測和分析，詳細地描述了各細胞群體間的相互關(guān)系，即正常人外周血中TCRVα24＋NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞間除在CD4亞群和CD45RA初始細胞亞群間有顯著相關(guān)外，其余各亞群相關(guān)較少，更進一步驗證了NKT細胞與傳統(tǒng)T細胞之間差異較大，是一群特殊的T細胞群體。造成這種差異的原因與NKT細胞的發(fā)育過程密切相關(guān)，研究表明雖然NKT細胞和傳統(tǒng)T細胞都是在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟，也同樣經(jīng)歷了陽性選擇和陰性選擇的發(fā)育過程，但是NKT細胞在胸腺內(nèi)分化發(fā)育的模式、選擇性抗原的種類以及調(diào)控機制等都有別于傳統(tǒng)T細胞。NKT細胞在腫瘤免疫、移植免疫、自身免疫和抗感染免疫方面發(fā)揮的作用越來越受到人們重視，深入了解該細胞的各種特性將有利于將該群細胞盡早應(yīng)用于臨床。

有趣的是在初始細胞亞群上兩群細胞間也表現(xiàn)出了顯著正相關(guān)，即正常人外周血中初始NKT細胞越多，則相應(yīng)的傳統(tǒng)初始T細胞也越多。NKT細胞是一群固有免疫細胞，除了在固有免疫應(yīng)答階段發(fā)揮重要作用以外，還可以連接固有免疫和適應(yīng)性免疫；傳統(tǒng)T細胞是適應(yīng)性免疫細胞，介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［13］。固有免疫和適應(yīng)性免疫是相輔相成、密不可分的。固有免疫是適應(yīng)性免疫的先決條件和啟動因素，適應(yīng)性免疫的效應(yīng)分子也可大大促進固有免疫應(yīng)答的發(fā)生。我們判斷固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的這種關(guān)系可能是造成初始NKT細胞和傳統(tǒng)初始T細胞間顯著相關(guān)的主要原因，所以我們推測記憶型NKT細胞與記憶型傳統(tǒng)T細胞之間也可能存在某種相關(guān)性，有待進一步研究。

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（2014－09－17 收稿）

Correlation of TCRVα24＋NKT Cells and Conventional T Cells in the Peripheral Blood of Normal Persons:A Multi－color Flow Cytometry Analysis

Yao Chunyan1，Jiang Lina2，Wang Hongtao1et al
1Department of Immunology，Anhui Key Laboratory of Infection and Immunity，
2Department of Pathophysiology，Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China

ObjectiveTo examine the correlation between TCRVα24＋NKT cells and conventional T cells in terms of their frequency and proportion of subsets in peripheral bloods of normal persons.Methods Five－color fluorescence staining and flow cytometry were used to detect the frequency of TCRVα24＋NKT cells and conventional CD3＋T cells in the peripheral blood of normal persons（n＝30），and the proportions of CD4＋，CD8＋，double negative and CD45RA＋subset in NKT cells and conventional CD3＋T cells were measured as well.The difference and correlation between NKT cells and conventional CD3＋T cells were analyzed by using the statistical software.Results The frequency of NKT cells was 0.35%（0.10%－1.50%）and that of conventional T cells was 58.4%（43.2%－72.5%）.The proportions of CD4＋，CD8＋，double negative and CD45RA＋subset in NKT cells were 69.1%（21.3%－90.9%），15.0%（4.5%－76.2%），9.5%（0.7%－69.4%）and 32.4%（6.8%－54.0%），respectively，and those of each subset in conventional CD3＋T cells were 54.7%（27.0%－74.7%），33.7%（19.9%－48.2%），10.2%（1.9%－24.4%）and 39.8%（10.3%－63.0%），respectively.No correlations were found between TCRVα24＋NKT cells and conventional CD3＋T cells except CD4and CD45RA subsets between the two cells（r＝0.435 5，P＜0.05；r＝0.829 5，P＜0.01）.There was an inverse correlation between the frequency of total NKT cells and the percentage of CD4＋NKT cells，while a positive correlation was noted between the frequency of NKT cells and the percentage of CD8＋NKT cells（r＝－0.680 2，P＜0.01；r＝0.401 7，P＜0.05）.Conclusion There was little correlation between TCRVα24＋NKT cells and conventional T cells in peripheral bloods of normal persons except CD4＋and CD45RA＋subsets.

flow cytometry； NKT cell； correlation

R737.9

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.015

＊安徽省教育廳自然科學(xué)研究項目（No.KJ2011Z253）

姚春艷，女，1978年生，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，E－mail:yaochunyan051＠126.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:bb＿bqli＠163.com