蘇婷婷，何云綺

（新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453000；1遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563000）

多慮平聯(lián)合促紅素治療慢性病貧血的臨床研究

蘇婷婷，何云綺1

（新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453000；1遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563000）

目的：通過對慢性病貧血(ACD)血清中Hepcidin、IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α表達(dá)水平變化分析，初步探索多慮平改善貧血的可能作用機(jī)制。方法：將60例ACD隨機(jī)分為4組。對照組(C)：僅治療ACD的基礎(chǔ)病。單純多慮平治療組(SD)：多慮平75 mg/d，口服。單純EPO治療組(SE)：EPO 150 U/kg，皮下注射，每周三次。多慮平聯(lián)合EPO治療組(DE)：EPO150 U/kg，皮下注射，每周三次；加多慮平75 mg/d，口服。用自動化血液分析儀檢測血常規(guī)，Elisa法檢測上述因子的血清含量。結(jié)果：與C組相比，SD組、SE組、DE組血清中的檢測因子水平均顯著下降(P＜0.05)；與SE組相比，SD組血清中的檢測因子水平改變不明顯(P＞0.05)；而DE組卻明顯下降且Hb明顯上升(P＜0.05)。與SD組相比，DE的血清檢測因子水平明顯下降且Hb明顯上升(P＜0.05)。結(jié)論：多慮平可降低ACD患者血清中檢測因子的水平；多慮平與EPO二者聯(lián)合治療ACD的效果，明顯優(yōu)于兩藥物的單獨(dú)使用。

慢性病貧血；促紅素；多慮平；鐵調(diào)素

慢性病貧血(ACD)是一種發(fā)病率僅次于缺鐵性貧血的第二大貧血性疾病。常因慢性炎癥、慢性感染、腫瘤、創(chuàng)傷及外科手術(shù)而產(chǎn)生，故又稱炎癥性貧血。上述因素會誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)ACD的發(fā)生、發(fā)展[1]。Hepcidin是一種主要由肝臟產(chǎn)生的在感染、炎癥和損傷的刺激下可以強(qiáng)烈表達(dá)的具有25個(gè)氨基酸的抗菌多肽[2]。它可以影響鐵的代謝而促進(jìn)ACD的發(fā)生[3-5]。本研究基于應(yīng)用組胺拮抗劑，可顯著降低IL-6的血清水平，進(jìn)而下調(diào)Hepcidin表達(dá)的這一原理，以期實(shí)現(xiàn)對ACD的治療。因此，采用多慮平為主要研究對象，以多慮平、EPO及多慮平聯(lián)合EPO作為治療組，通過治療前后的縱向?qū)Ρ燃案髦委熃M之間差異的橫向?qū)Ρ?，為ACD的靶向治療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集與整理

本實(shí)驗(yàn)按ACD診斷標(biāo)準(zhǔn)（參照張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第2版）篩選遵義市第一人民醫(yī)院2011年3月至2012年9月住院ACD患者60例。其中，男12例，女48例，年齡56歲～71歲。腫瘤相關(guān)性貧血20例，惡性血液病12例，炎癥性貧血20例，免疫相關(guān)疾病8例。所有患者此前均未經(jīng)輸血或鐵劑治療，空腹抽取靜脈血，分離出血清，-80℃保存待測。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥物

Hepcidin、IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α等Elisa試劑盒各一個(gè)，均購自美國ASSAY公司。多慮平購自南京白敬宇制藥。雪達(dá)升（rhEPO）購自哈藥集團(tuán)生物工程有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及處理

按照ACD基礎(chǔ)病的不同，將60例ACD患者分為四組：對照組(C)：僅治療基礎(chǔ)病；單純多慮平治療組(SD)：給予多慮平75 mg/d，口服；單純EPO治療組(SE)：給予EPO 150 U/kg，皮下注射，每周三次；多慮平聯(lián)合EPO治療組(DE)：EPO 150 U/kg，皮下注射，每周三次；加多慮平75 mg/d，口服。

2.2 標(biāo)本處理及保存

①清晨抽取空腹靜脈血，選取肘窩靜脈為抽血部位，準(zhǔn)確采取靜脈血4 mL左右，立即混勻（輕輕翻轉(zhuǎn)5～10次），再次核對標(biāo)本編號，4 h內(nèi)以2 500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心20 min左右，仔細(xì)收集上清，存于-80℃低溫冰箱；②同期采血檢測血常規(guī)及其他相關(guān)檢查項(xiàng)目。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

①準(zhǔn)備標(biāo)本、試劑：將實(shí)驗(yàn)備用標(biāo)本（經(jīng)檢測不含有NaN3樣品）從-80℃超低溫冰箱取出,置于室溫下使標(biāo)本解凍，將試劑盒從2～8℃冰箱中取出，平衡至室溫30min后開啟使用；②標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將原倍標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)按照使用說明加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(Standard Diluent)，分別稀釋成800 ng/mL、400 ng/ mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL，并對應(yīng)標(biāo)記為5、4、3、2、1號標(biāo)準(zhǔn)品；③加樣：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μl、鏈霉素-HRP 50 μL；待測樣品孔加入：樣本40 μl、抗-HEPCIDIN抗體10 μL、鏈霉素-HRP50 uL；蓋上封板膜，輕輕震蕩，使之混勻，在37℃的恒溫環(huán)境中1 h；④配液：用蒸餾水將30倍的濃縮洗滌液稀釋30倍后備用；⑤洗滌：輕輕將封板膜揭去，傾去液體并甩干，將洗滌液滴加于各孔之中，靜置30 s后棄去，本步驟需重復(fù)5次；⑥顯色：每孔依次加入顯色劑A與顯色劑B各50 μL，注意A與B順序不能改變，小心震蕩使之混勻，37℃環(huán)境下，避光顯色10 min；⑦終止：每孔滴加50 μL終止液，終止反應(yīng)，其標(biāo)志為藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色；⑧測定：將空白孔調(diào)零，在450 nm波長下依次測量各孔的吸光度（OD值），該步驟須在加入終止液10 min內(nèi)進(jìn)行；⑨計(jì)算：以O(shè)D值為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用curve expert 1.3軟件對所得結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算其直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值計(jì)算出其濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用x±s進(jìn)行描述，采用方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、配對樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 治療前各分組資料對比

表1 各組基線資料對比

表2 治療前紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)（±s）

表2 治療前紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)（±s）

G C S D SE DE F P n 15 15 15 15 Hb(g/L) 64.01±10.64 64.36±11.68 65.58±7.62 63.31±8.31 0.143 0.934 RBC(×1012/L) 2.85±0.20 2.74±0.33 2.93±0.33 2.76±0.52 0.886 0.454 HCT(%) 31.72±3.27 33.20±2.40 33.58±1.53 29.93±2.14 1.689 0.180 MCV(fl) 80.44±3.92 82.13±1.75 81.47±2.48 82.90±2.07 2.261 0.091 MCH(pg) 33.27±4.59 34.39±2.02 32.35±2.47 34.07±1.71 1.466 0.234

表3 治療前Hepcidin與細(xì)胞因子（±s）

表3 治療前Hepcidin與細(xì)胞因子（±s）

G C S D SE DE F P n 15 15 15 15 Hep(ug/L) 52.51±17.96 54.77±10.41 56.77±11.86 55.28±9.64 0.282 0.838 IL-1(ng/L) 36.65±1.74 36.36±1.11 37.28±0.94 36.79±0.78 1.550 0.212 IL-6(ng/L) 43.67±19.66 40.90±12.08 43.47±10.01 41.60±9.61 0.156 0.925 IL-10(ng/L) 35.61±2.88 37.93±4.01 35.62±6.59 35.00±4.92 1.086 0.363 TNF-α(ug/L) 25.84±5.05 28.46±3.39 27.81±3.19 28.18±3.69 1.387 0.256

表1～3說明，各組資料的性別、年齡無明顯差異，且在治療前各檢測指標(biāo)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即各組資料具有同質(zhì)性。

4.2 各組治療前后結(jié)果對比

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)自身研究，為進(jìn)一步說明各組治療結(jié)果前后的差異，特進(jìn)行配對樣本t檢驗(yàn)，其結(jié)果如表4～5。

表4 各組治療前后紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)配對t檢驗(yàn)結(jié)果

表5 各組治療前后Hepcidin、細(xì)胞因子配對t檢驗(yàn)結(jié)果

由表4～5可知，C組治療前后的各項(xiàng)檢測指標(biāo)無明顯變化，即僅針對基礎(chǔ)病的治療，不能改善貧血癥狀；而SD與SE組治療前后各檢測指標(biāo)均具有明顯變化，即多慮平與EPO一樣，均可用于貧血的治療。DE組治療前后各檢測指標(biāo)也具有明顯變化，說明二者存在協(xié)同效應(yīng)。

4.3 治療后紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)、Hepcidin及細(xì)胞因子檢查結(jié)果

按照實(shí)驗(yàn)已設(shè)定各組治療方案進(jìn)行治療，治療1月后，再次抽取靜脈血進(jìn)行紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)檢測及Hepcidin、細(xì)胞因子的ELISA法測定，結(jié)果如表6，7。

表6 治療后紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)（x±s）

由上表得知，與C相比，SD、SE、DE的Hb、RBC、HCT均明顯上升，(P＜0.05)；但所有治療組中MCV及MCH變化不明顯(P＞0.05)。與SE相比，SD的Hb、RBC、HCT、MCV、MCH變化不明顯(P＞0.05)。與DE相比，SD、SE的Hb、RBC、HCT變化明顯(P＜0.05)；而MCV、MCH變化不明顯(P＞0.05)。

表7 治療后Hepcidin與細(xì)胞因子（x±s）

由上表得知，①與C相比，單純多慮平組SD、SE、DE的Hepcidin及細(xì)胞因子的血清含量均明顯下降(P＜0.05)；②與SE相比，SD的Hepcidin及細(xì)胞因子的血清含量變化不明顯(P＞0.05)；③與DE相比，SD、SE的Hepcidin及細(xì)胞因子的血清含量變化明顯(P＜0.05)。

5 討論

慢性病貧血(anemia of chronic disease,ACD)是臨床上常見的貧血類型[6-7]，多由正細(xì)胞正色素貧血過渡為小細(xì)胞低色素貧血，以血清鐵、總鐵結(jié)合力及骨髓鐵粒幼細(xì)胞降低,而血清鐵蛋白及單核-巨噬細(xì)胞儲存鐵增加為其臨床特點(diǎn)[8]。

Hepcidin是一種在肝細(xì)胞合成的具有抗微生物活性的多肽，可以調(diào)節(jié)鐵的吸收、利用和貯存之間的平衡[9-10]。通過抑制MMS釋放鐵及腸道鐵的吸收，在ACD的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。

IL-1、IL-6等細(xì)胞因子，在細(xì)菌內(nèi)毒素及單核-巨噬細(xì)胞激活誘導(dǎo)下可以大量產(chǎn)生。其中，IL-6既可以增加鐵蛋白(ferritin,Fn)的H鏈和L鏈的表達(dá)，又可以通過IL-6/STAT3途徑調(diào)節(jié)hepcidin大量表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致貧血的產(chǎn)生。IL-1可以刺激中性粒細(xì)胞釋放乳鐵蛋白增加，后者既可以與轉(zhuǎn)鐵蛋白競爭與鐵的結(jié)合，也可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞鐵代謝異常，最終導(dǎo)致低鐵血癥。IL-10是一種炎癥抑制因子，可以抑制多種致炎性細(xì)胞因子的分泌[11]，既可刺激Hepcidin的肝臟表達(dá)，抑制腸細(xì)胞鐵吸收和單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)儲鐵釋放，又可上調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)，增加轉(zhuǎn)鐵蛋白受體調(diào)控的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵向單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。

TNF-α既可抑制EPO的產(chǎn)生，使骨髓對EPO的反應(yīng)降低，也可抑制紅系集落形成單位(burstforming unit-erythroid,CFU-E)。此外，TNF-α還可引起轉(zhuǎn)鐵蛋白減少，導(dǎo)致貧血[13]。

多慮平屬于三環(huán)類抗抑郁藥物，既往臨床上主要用于治療各種憂郁癥，近年也被用于神經(jīng)性皮炎、重癥帶狀皰疹神經(jīng)痛、蕁麻疹、慢性濕疹等皮膚病的治療，劑量為多慮平25 mg，每日3次口服[14]。不良反應(yīng)主要為輕微口干、頭昏。它有很強(qiáng)的抗H1受體作用，比傳統(tǒng)的抗組胺藥苯海拉明強(qiáng)100倍，是賽庚啶的11倍,與H1受體的結(jié)合力為一般抗組胺藥的800倍。

本研究發(fā)現(xiàn)：炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α與炎癥抑制細(xì)胞因子IL-10在ACD患者的血清中均呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，考慮可能是由于治療前持續(xù)高表達(dá)的IL-1、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子，刺激IL-10的高表達(dá)來對抗產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。孫國華等在對前列腺增生及前列腺癌組織中IL-10的表達(dá)研究中得出了相似的結(jié)論[14]。隨著ACD患者的治療，促炎因子的水平下降，這種對抗作用減退而使IL-10的水平得到下降。

對C組患者的觀察發(fā)現(xiàn)，針對基礎(chǔ)病治療后，患者的Hb水平雖有所提高，但是與治療前進(jìn)行配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這種提高考慮是基礎(chǔ)病得到改善后，機(jī)體內(nèi)部調(diào)節(jié)所致。

與C組相比，各治療組患者治療后的血清中Hepcidin與IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α的水平均顯著下降；而患者Hb明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這說明多慮平、EPO及二者的聯(lián)合應(yīng)用均可降低血清Hepcidin及上述細(xì)胞因子水平，隨著血清Hepcidin的下降，使血清中可以利用的鐵增加，故貧血得以改善。

SD組結(jié)果顯示：單純給予多慮平治療后，患者的血清Hepcidin及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子水平較治療前明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而Hb水平較治療前明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其機(jī)理可能為多慮平通過下調(diào)血清IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子水平降低Hepcidin的表達(dá)，進(jìn)而使患者的Hb升高。

SE組結(jié)果顯示：單用EPO治療后，患者的血清Hepcidin及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子水平較治療前明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而Hb水平較治療前明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本結(jié)果與國內(nèi)外眾多學(xué)者研究一致。其機(jī)理為EPO可以降低血清中的hepcidin及血清中的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子水平，有助于改善貧血癥狀。

本研究結(jié)果還顯示：多慮平聯(lián)合EPO治療組(DE組)治療后與SD、SE組治療后相比較，患者血清中Hepcidin及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子的水平下降更明顯；而Hb的升高也更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而SD組與SE組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這說明在降低患者血清hepcidin及上述細(xì)胞因子的水平方面，EPO與多慮平可能存在某種協(xié)同效應(yīng)。即二者聯(lián)合治療ACD的效果明顯優(yōu)于兩藥物的單獨(dú)使用。

綜上所述，多慮平可以降低hepcidin及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子的血清水平。多慮平與EPO的聯(lián)合治療效果明顯優(yōu)于兩藥物的單獨(dú)使用，其機(jī)理可能為兩者在對ACD的治療方面存在協(xié)同效應(yīng)或疊加結(jié)果，為本研究治療ACD患者的最佳方法。但多慮平聯(lián)合EPO這一新的治療方法能否縮短ACD的治療時(shí)間、減少EPO的劑量以及二者之間的生物學(xué)協(xié)同機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。此外，由于本實(shí)驗(yàn)系小樣本、短期臨床研究，單用多慮平能否有效治療ACD，還需要大量更深入、細(xì)致的研究來加以印證。

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（2014-11-03收稿）

作者投稿系統(tǒng)http∶//xb.lzmc.edu.cn/

Clinical study of treatment of anemia of chronic disease by doxepin and erythropoietin

Su Tingting，He Yunqi1
Department of Hematology,the First People’s Hospital of Xinxiang;1Department of Hematology,the First People’s Hospital of Zunyi

Objective:To detect the changes of serum hepcidin,IL-1,IL-6,IL-10 and TNF-α in treatment of anemia of chronic disease(ACD)by doxepin to preliminarily explore its the mechanism.Methods:Sixty patients were divided into control group doxepin treatment group，EPO treatment group and doxepin combined EPO treatment group.The blood routine of the fresh samples were measured by automated blood analyzers and the levels of hepcidin,IL-1,IL-6,IL-10 and TNF-α in serum were detected by ELISA.Results:Compared with control group,the serum levels of above factors in treatment groups were significantly reduced(P＜0.05). Compared to EPO treatment group,serum levels of above factors in doxepin treatment group were not significantly reduced(P＞0.05),but significantly reduced in doxepin combined EPO treatment group(P＜0.05).The hemoglobin level was also significantly increased in combined group.Compared with doxepin treatment group,in doxepin combined EPO treatment group the serum levels of above factors in Doxepin combined EPO treatment group were significantly reduced while the hemoglobin level was significantly increased(P＜0.05).Conclusion: Doxepin may reduce the serum levels of hepcidin.in ACD patients.Doxepin combined EPO seems much better than single use of EPO or doxepin in treating patients with ACD.

ACD;Erythropoietin;Doxepin;Hepcidin

R556.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.011

蘇婷婷（1988-），女，住院醫(yī)師，碩士，E-mail:sutingtiag 2010@163.com