且亞玲，汪春梅，陽靜，湯艷

（瀘州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,四川瀘州646000）

2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚染毒對大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NMDA受體亞基基因NR1和NR2B的影響*

且亞玲，汪春梅，陽靜，湯艷

（瀘州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,四川瀘州646000）

目的:觀察2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromo-diphenyl ethers，BDE-47）染毒后大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B的變化，探討B(tài)DE-47暴露對學(xué)習(xí)記憶的影響及其機制。方法:將80只SD雄性大鼠隨機分為空白對照組、溶劑對照組、BDE-47（0.1 mg/Kg、0.5 mg/Kg和1.0 mg/Kg）劑量組，每組16只，每天灌胃1次，持續(xù)30 d；用Morris水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶，用免疫組化檢測大鼠NMDA受體亞基NR1和NR2B的表達，用RT-PCR檢測大鼠NMDA受體亞基NR1和NR2B的基因表達。結(jié)果：在水迷宮試驗中：與溶劑對照組比較，BDE-47染毒各組的平均逃避潛伏期明顯增加、穿越平臺的次數(shù)和在原平臺象限停留的時間明顯減少（P＜0.05），且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果：與溶劑對照組比較，各染毒組大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B表達明顯減少（P＜0.05），且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。RT-PCR結(jié)果與溶劑對照組比較，BDE-47染毒各組大鼠海馬NMDA受體亞基NR1的基因表達明顯減少（P＜0.05）；各染毒劑量組之間，隨著染毒劑量的增加，大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B的基因表達減少（P＜0.05）。結(jié)論:BDE-47染毒后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，可能與大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B減少有關(guān)。

BDE-47；海馬；NMDA受體；學(xué)習(xí)記憶

2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ethers,BDE-47）是環(huán)境和人體中含量最高的PBDEs同系物，BDE-47不僅對環(huán)境造成嚴重污染，還對人群健康存在潛在的危害。實驗數(shù)據(jù)表明BDE-47對實驗動物具有一定的肝臟毒性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾毒性，對人類具有潛在的神經(jīng)行為毒性[1-2]。但是目前對BDE-47的神經(jīng)行為毒性研究才剛起步，故本研究以成年大鼠為研究對象，模擬BDE-47環(huán)境暴露劑量，對大鼠染毒一個月，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B的變化，研究低劑量BDE-47暴露對學(xué)習(xí)記憶的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性Sprague Dawley大鼠80只（由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供），體重200 g±10 g，活動和學(xué)習(xí)能力相近。飼養(yǎng)條件，溫度23.1℃，濕度50%± 10%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

Morris水迷宮（北京碩林苑科技有限公司），SW-LJ-IF超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；8751超低溫冰箱（美國Forma公司）；5417高速低溫離心機（德國Eppendorf公司）；SIF-M124制冰機（日本三洋公司）；GeneAmp 9700型PCR儀（ABI）；ND-1000核酸蛋白檢測儀（美國Nanodrop公司）；Tannon2500凝膠圖像掃描系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

1.2.2 主要試劑

BDE-47（純度100%，美國AccuStandard公司），NR1和NR2B抗體（Bioworld Technology inc）；Rever Tra Ace組合型RT-PCR試劑盒（成都博瑞克生物技術(shù)有限公司）；Trizol試劑和焦碳酸乙二脂（DEPC）（Invitrogen公司）；溴化乙錠（上海生物工程有限公司）。

1.3 動物模型的建立

利用隨機數(shù)據(jù)表將80只SD雄性大鼠隨機分為：空白對照組、溶劑對照組、BDE-47低劑量（0.1 mg/kg）組、中劑量（0.5 mg/kg）組、高劑量（1.0 mg/kg）組，每組16只。每天上午9∶00～11∶00，對BDE-47低、中、高劑量組分別按0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/ kg灌胃給予BDE-47（BDE-47用純花生油配置），溶劑對照組按1.0 mg/kg灌胃給予純花生油，連續(xù)灌胃30 d。

1.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶的測定

BDE-47染毒結(jié)束后第2 d，用Morris水迷宮對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進行測試，測試方法參照文獻[3]進行。①定位航行實驗：歷時4 d，觀察和記錄每天大鼠尋找平臺的逃避潛伏期，并計算平均逃避潛伏期;②空間搜索實驗：即在第4 d最后1次訓(xùn)練后撤除水下平臺，然后任選同一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)跨過平臺相應(yīng)位置的次數(shù)。

1.5 大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B免疫組化的測定

水迷宮測試結(jié)束后,用10%水合氯醛對大鼠腹腔注射,麻醉后立即開胸暴露心臟,經(jīng)左心室插管至主動脈,同時剪開右心耳,快速灌注生理鹽水,至肝臟變白改灌注液為4%多聚甲醛,灌注時間約30 min,見大鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意,然后開顱快速取出大腦組織投入4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋切片,免疫組化按免疫組化試劑盒說明進行。用Image-Proó Plus 6.0(IPP)分析免疫組化圖片的光密度。

1.6 大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B的基因表達檢測（RT-PCR）

1.6.1 組織總RNA的提取

BDE-47染毒結(jié)束后第2 d，斷頭處死大鼠，快速取海馬，剪取80 mg，剪碎后轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，加入1 mL Trizol進行勻漿處理。室溫放置5 min后加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min，4℃12 000 r/min離心15 min。轉(zhuǎn)移水相于新EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后冰上沉淀10 min，4℃12 000 r/min離心10 min，管底部可見膠狀RNA沉淀，棄上清，加1 mL 75%乙醇充分混勻洗滌RNA沉淀，4℃7 500 r/min離心5 min，棄上清。室溫放置干燥約10 min后用無RNase的水進行溶解。核酸蛋白檢測儀上檢測提取的總RNA濃度、純度。

1.6.2 cDNA的合成

取1 μg總RNA做模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系：總RNA 1 μg，dNTP Mixture 2 μL，5×RT buffer 4 μL，Super RI 0.5 μL，RF enhancer 0.5 μl，Random Primer 1 μL，Rever Tra Ace酶1 μL，補DEPC水至終體積20 μL。按以下程序進行cDNA的合成：30℃10 min，42℃20 min，99℃5 min。

1.6.3 PCR擴增目的基因

取上述產(chǎn)物進一步進行PCR擴增，反應(yīng)體系中含cDNA 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，補水至終體積20 μL。基因名稱和對應(yīng)的引物序列、擴增條件，表1。

表1 PCR引物序列和擴增條件

1.7 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組間均數(shù)比較采用重復(fù)測量方差分析和單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BDE-47對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2.1.1 定航實驗

在Morris水迷宮定航實驗中，重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示：訓(xùn)練時間和染毒劑量對大鼠平均逃避潛伏期的影響無交互作用（F=0.62，P=0.65），不同訓(xùn)練時間的染毒組大鼠的平均逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=638.30，P＜0.0001）。同一訓(xùn)練時間，BDE-47染毒組平均逃避潛伏期均高于溶劑對照組（P＜0.05），且隨染毒劑量的增加而增加（P＜0.05），空白對照組與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05，表2。

表2 大鼠Morris水迷宮定航實驗平均逃避潛伏期（±s，n=16）

表2 大鼠Morris水迷宮定航實驗平均逃避潛伏期（±s，n=16）

注：a.表示與空白對照組比較，P＞0.05；b.表示與溶劑對照組比較，P＜0.05；c.表示與BDE-47低劑量組比較，P＜0.05；d.表示與BDE-47中劑量組比較，P＜0.05

組別空白對照組溶劑對照組低劑量組中劑量組高劑量組F P第1 d 29.27±6.46 32.17±5.98a42.32±6.34b49.42±5.25bc55.85±4.94bcd37.83＜0.001第2 d 26.62±5.40 25.46±3.35a36.19±6.05b48.16±5.89bd52.46±4.89bcd50.49＜0.001第3 d 11.68±4.96 12.10±4.19a24.55±5.21b32.07±7.29bc42.64±7.66bcd49.26＜0.001第4 d 5.26±3.84 6.89±3.48a11.68±5.89b16.89±6.15bc26.92±6.34bcd34.16＜0.001

2.1.2 空間搜索實驗

在Morris水迷宮空間實驗中，BDE-47低、中、高劑量組大鼠穿越原平臺的次數(shù)和在原平臺象限停留的時間較溶劑對照組明顯減少（P＜0.05），且隨染毒劑量的增加而減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），空白對照組與溶劑對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05，表3。

表3 各組成年大鼠Morris水迷宮空間搜索實驗垮臺次數(shù)（±s，n=16）

表3 各組成年大鼠Morris水迷宮空間搜索實驗垮臺次數(shù)（±s，n=16）

注：a.表示與空白對照組比較，P＞0.05；b.表示與溶劑對照組比較，P＜0.05；c.表示與BDE-47低劑量組比較，P＜0.05；d.表示與BDE-47中劑量組比較，P＜0.05

在原平臺象限停留時間33.37±5.90 35.89±5.15a26.83±5.32b16.90±5.00bc12.11±4.60bcd65.07＜0.0001組別空白對照組溶劑對照組低劑量組中劑量組高劑量組F P穿越原平臺的次數(shù)4.92±1.96 4.73±1.42a3.77±1.25b2.67±1.10bc1.38±0.88bcd26.69＜0.0001

2.2 BDE-47對大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B的影響

2.2.1 免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B陽性表達在胞漿，染色為黃色，染色越深陽性表達就越多。與溶劑對照組比較，各染毒組大鼠海馬CA1、CA3和齒狀回（DG）的NMDA受體亞基NR1和NR2B表達明顯減少（P＜0.05）；且隨著染毒劑量的增加，大鼠海馬CA1、CA3和齒狀回（DG）的NMDA受體亞基NR1和NR2B陽性表達均逐漸減少（P＜0.05），溶劑對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），圖1、圖2和表4。2.2.2 RT-PCR結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示：與溶劑對照組比較，BDE-47染毒各組大鼠海馬NMDA受體亞基NR1的基因明顯減少（P＜0.05），BDE-47染毒中劑量、高劑量組大鼠海馬NMDA受體亞基NR2B的基因明顯減少（P＜0.05）；各染毒劑量組之間，隨著染毒劑量的增加，大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B的基因均逐漸減少（P＜0.05），溶劑組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表5和圖3。

圖1 大鼠海馬NMDA受體亞基NR1的表達結(jié)果（×400）

圖2 大鼠海馬NMDA受體亞基NR2B的表達結(jié)果（×400）

表4 大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B的光密度值（±s，n=8）

表4 大鼠海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B的光密度值（±s，n=8）

注：a.表示與空白對照組比較，P＞0.05；b表示與溶劑對照組比較，P＜0.05；c.表示與BDE-47低劑量組比較，P＜0.05；d.表示與BDE-47中劑量組比較，P＜0.05

組別空白對照組溶劑對照組低劑量組中劑量組高劑量組F P CA1 0.1685±0.0110 0.1615±0.0084a0.1275±0.0062b0.1012±0.0111bc0.0633±0.0083bcd176.72＜0.0001 NR1 NR2B CA3 0.1577±0.0079 0.1608±0.0063a0.1291±0.0056b0.0947±0.0059bc0.0588±0.0060bcd369.92＜0.0001 DG 0.1579±0.0100 0.1679±0.0117a0.1338±0.0140b0.1063±0.0078bc0.0789±0.0163bcd70.94＜0.0001 CA1 0.1699±0.0077 0.1712±0.0076a0.1709±0.0091b0.1093±0.0081bc0.0718±0.0136bcd181.77＜0.0001 CA3 0.1807±0.0130 0.1829±0.0108a0.1876±0.0123b0.1437±0.0101bc0.1013±0.0124bcd78.48＜0.0001 DG 0.2237±0.0107 0.2208±0.0110a0.2170±0.0132b0.1673±0.0101bc0.1099±0.0110bcd152.97＜0.0001

表5 大鼠海馬NMDA受體亞基NR1的基因表達（±s，n=8）

表5 大鼠海馬NMDA受體亞基NR1的基因表達（±s，n=8）

注：a.表示與空白對照組比較，P＞0.05；b.表示與溶劑對照組比較，P＜0.05；c.表示與BDE-47低劑量組比較，P＜0.05；d.表示與BDE-47中劑量組比較，P＜0.05

組別空白對照組溶劑對照組低劑量組中劑量組高劑量組F P NR1 2.2381±0.1027 2.1835±0.0898a1.7637±0.1044b1.3097±0.0465bc1.1049±0.0400bcd310.26＜0.0001 NR2B 0.8822±0.0721 0.9060±0.0693a0.8950±0.0827 0.6202±0.0583c0.4685±0.0320cd78.68＜0.0001

圖3 大鼠海馬NMDA受體亞基NR1的基因表達

3 討論

目前BDE-47的神經(jīng)行為毒性已經(jīng)成為全球研究的熱點之一。國外學(xué)者Eriksson等[4]研究發(fā)現(xiàn)，一次給予剛出生10 d的小鼠10.5 mg/kg的BDE-47，導(dǎo)致小鼠運動行為異常，成年后學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。國內(nèi)學(xué)者何平等[5]用5 mg/kg和10 mg/kg的BDE-47單次染毒剛出生10 d的SD大鼠，導(dǎo)致大鼠兩個月齡時空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量（0.1 mg/Kg、0.5 mg/Kg和1.0 mg/Kg）BDE-47染毒成年大鼠1月后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。

海馬是腦邊緣系統(tǒng)中重要的結(jié)構(gòu)之一，是學(xué)習(xí)記憶等高級神經(jīng)活動的重要部位。國內(nèi)學(xué)者何衛(wèi)紅等[5-7]研究發(fā)現(xiàn)BDE-47可致原代新生大鼠海馬細胞氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)細胞DNA損傷和凋亡以及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損傷、影響大鼠海馬區(qū)鈣信號誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平。表明BDE-47可通過損害海馬神經(jīng)元，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的下降，具有一定神經(jīng)行為發(fā)育毒性。海馬長時程突觸增強（long-term potentiation，LTP）是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。Dingeman等[8]用BDE-47 6.8 mg/kg/d染毒出生10 d小鼠，海馬長時程增強效應(yīng)和強直刺激后增強效應(yīng)減弱。N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methy-D-Aspartic acid，NMDA）受體為代表的活動依賴的興奮性離子型谷氨酸受體在LTP形成和維持中具有重要作用。NMDA受體有7種NMDA受體亞單位，即NRI、NR2A～D、NR3A和NR3B。NR1為功能亞單位，是NMDA受體的必需組分，選擇性敲除小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的NR1亞單位后，其NMDA受體誘導(dǎo)的LTP被破壞，且小鼠表現(xiàn)為空間記憶障礙。NR2是調(diào)節(jié)亞單位，胞外段有谷氨酸結(jié)合位點，胞內(nèi)段C端較長且包含有磷酸化位點，并由此調(diào)節(jié)受體功能和活化水平，應(yīng)用反義寡核苷酸選擇性敲除幼年大鼠海馬NR2B亞單位后，NMDA受體的反應(yīng)性降低，NMDA受體依賴性LTP喪失，同時空間學(xué)習(xí)能力受損[9]。而本研究發(fā)現(xiàn)低劑量（0.1 mg/ Kg、0.5 mg/Kg和1.0 mg/Kg）BDE-47染毒成年大鼠1月后，海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B蛋白和基因表達減少，故提示低劑量BDE-47染毒對學(xué)習(xí)記憶的損害可能與海馬NMDA受體亞基NR1和NR2B表達減少有關(guān)，但是具體的作用機制還需進一步研究。

1.Li T,Wang W,Pan YW,et al.hydroxylated metabolite of flame-retardant PBDE-47 decreases the survival,proliferation,and neuronal differentiation of primary cultured adult neural stem cells and interferes with signaling of ERK5 MAP kinase and neurotrophin 3[J].Toxicol Sci, 2013,134(1):111-124.

2.Wilford BH,Shoeib M,Harner T,et al.Polybrominated diphenyl ethers in indoor dust in Ottawa,Canada:implications for sources and exposure[J].Environ Sci Technol, 2005,39(18):7027-7035.

3.袁瓊嘉,李垂坤,李雪,等.長期中等負荷運動對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)黏附分子的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2012,31(12):1075-1080.

4.Eriksson P,Ankarberg E,Viberg H,et al.The developing cholinergic system as target for environmental toxicants,nicotine and polychlorinated biphenyls(PCBs):implications for neurotoxicological processes in mice[J].Neurotox Res,2001,3(1):37-51.

5.何平,王愛國,夏濤,等.BDE-47單獨和與PCB-153聯(lián)合染毒對大鼠神經(jīng)發(fā)育的影響[J].環(huán)境與健康雜志, 2008,25(9):763-766.

6.何衛(wèi)紅,何平,張明,等.2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚對原代新生大鼠海馬細胞氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡的影響[J].環(huán)境與健康雜志,2007,24(1):19-22.

7.夏濤,何平,王愛國,等.PBDE-47和PCB153染毒致大鼠神經(jīng)毒性作用[J].中國公共衛(wèi)生,2009,25(5):564-566.

8.Dingemans MM,Ramakers GM,GardoniF,et al. Neonatal exposure to brominated flame retardant BDE-47 reduces long-term potentiation and postsynapticprotein levels in mouse hippocampus[J].Environ Health Perspect, 2007,115(6):865-870.

9.Tang YP,Shimizu E,Dube GR,et al.Genetic enhancement of learning and memory in mice[J].Nature,1999, 401(6748):63-69.

（2015-01-06收稿）

作者投稿系統(tǒng)http∶//xb.lzmc.edu.cn/

Effect of BDE-47 exposure on learning and the expression of genes memory and NR1 and NR2B of Hippocampal neurons in adult rat

Qie Yaling，Wang Chunmei，Yang jiny，Tang Yan
Department of Public and Health,Luzhou Medical College

Objiective:To study the effect and mechanism of 2,2’,4,4’-tetrabromo-diphenyl ethers(BDE-47)exposure on spatial learning and memory abilities and the genes expression of NMDA-receptor subunit in adult rats.Methods:80 healthy male SD rats were randomly divided into control group,vehicle group and three BDE-47-treated groups.The latter3 treated groups were treated by intragastric administration of 0.1 mg/kg,0.5 mg/kg and 1.0 mg/kg BDE-47 once a day respectively.The rats in vechicle group

1.0 mg/kg of peanut oil.The administration was lasted for 30 days.After experiment the capability of learning and memory of rats were measured by Morris water maze test.The expressions of both subunits of NMDA-receptor were evaluated by immunohistochemisty.Results:In BDE-47-treated groups the average escape latency was increased compared with control group(P＜0.05),and the freguency the animal crossed the original platform and the time spent in quadrant of the original platform were decreased compared with control group and dosage related(P＜0.05).The expression of NR1 and NR2B in CA1,CA3 and dentate gyrus areas of hippocampus were significantly decreased in the BDE-47 treated groups compared with the vehicle group and dosage related(P＜0.05).And the expression mRNA of NR1 and NR2B showed statistically signifcant decrease in rats exposed to BDE-47.Conclusions: These findings show that the exposure to BDE-47 can induce behavioral alterations which may be due to the down-regulation of the genes expression of subunits of NMDA receptors.

2，2’，4，4’-tetrabromo-diphenylethers;Hippocampus;N-methy-D-Asparticacid;Learningandmemory

R114

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.001

四川省科技廳課題（2010JY0128）；四川省衛(wèi)生廳項目基金（100207）

且亞玲（1985-），女，助教，碩士，E-mail：690229222@qq.com

湯艷（1976-），女，副教授，碩士，E-mail：Tangyan200310@163.com