周翔宇，陳霞，黃娟，曾凡才

(1四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管甲狀腺外科,2四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科,3四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,4四川醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，四川瀘州646000)

論著

AR42J細(xì)胞自分泌Shh信號(hào)參與雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎*

周翔宇1，陳霞2，黃娟3，曾凡才4

(1四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管甲狀腺外科,2四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科,3四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,4四川醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，四川瀘州646000)

目的：觀察Hedgehog信號(hào)在急性胰腺炎（AP）體外模型中的表達(dá)變化。方法：不同濃度的雨蛙素誘導(dǎo)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞株AR42J，構(gòu)建AP體外細(xì)胞模型，重組Shh作用于AR42J細(xì)胞。采用RT-PCR、Western-blot分別檢測(cè)細(xì)胞Shh信號(hào)分子表達(dá)；ELISA檢測(cè)上清Shh水平。結(jié)果：與對(duì)照組相比，雨蛙素誘導(dǎo)組Shh的mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯升高，細(xì)胞自分泌Shh水平也明顯升高，呈雨蛙素濃度依賴性。重組Shh刺激后，Shh相關(guān)信號(hào)Shh、Gli1和Ptch1表達(dá)呈濃度依賴性地升高。結(jié)論：在雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞，自分泌的Shh信號(hào)參與急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制。

雨蛙素；AR42J；急性胰腺炎；Sonic Hedgehog信號(hào)

急性胰腺炎（Acute Pancreatitis,AP）是胰酶自身消化胰腺及周?chē)M織引起的炎癥，臨床常見(jiàn)，癥狀輕重不一，嚴(yán)重者可危及生命。目前認(rèn)為AP的發(fā)病包含復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)，始于胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)[1]。因此對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞早期事件的了解，有助于對(duì)AP分子病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)。急性胰腺炎癥過(guò)程中，腺泡細(xì)胞遭受損失的同時(shí)，必然啟動(dòng)組織的自身修復(fù)和再生機(jī)制，作為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和損傷后組織修復(fù)的重要信號(hào)-Hedgehog（Hh）信號(hào)，是否參與急性胰腺炎癥損傷的機(jī)制值得重視。Hh信號(hào)廣泛參與器官發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和損傷過(guò)程，我們前期的體內(nèi)研究證實(shí)Hh信號(hào)參與小鼠急性胰腺炎癥過(guò)程[2]。當(dāng)前的研究，采用雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞構(gòu)建AP的體外模型，進(jìn)一步探討Hh信號(hào)在AP中的表達(dá)變化，以期為AP發(fā)病的分子病理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立

大鼠胰腺腺泡細(xì)胞株AR42J購(gòu)自美國(guó)ATCC，細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取傳代2次且生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，分別加入含0、1、1.5、2、2.5、3 μM的雨蛙素（caerulein）（美國(guó)Sigma公司）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，以不加雨蛙素的細(xì)胞作為對(duì)照組。收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RT-PCR

Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）方法提取總RNA，使用SuperScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR，βactin作為內(nèi)參基因，所有反應(yīng)均在熒光定量?jī)xiCycler iQ（美國(guó)Bio-Rad公司）上進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后做溶解曲線。檢測(cè)Hh信號(hào)的3個(gè)亞基：Sonic hedgehog（Shh）、Indian hedgehog（Ihh）和Desert hedgehog（Dhh），以及Hedgehog信號(hào)通路下游分子Gli1和Ptch1。擴(kuò)增cDNA的序列，表1。

表1 RT-PCR使用的引物序列

1.2.2 Western-blot

Western-blot檢測(cè)Shh蛋白水平，取約100 mg胰腺組織勻漿，RIPA裂解液裂解1～1.5 h，超聲粉碎細(xì)胞，使用1×Buffer緩沖液溶解細(xì)胞，勻漿，離心，取上清液。提取總蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，上樣，經(jīng)分離、電泳將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，加入1∶200的Shh羊抗兔單克隆一抗孵育（美國(guó)Upstate公司），4℃過(guò)夜，加入1∶1 000的兔抗鼠二抗室溫孵育（美國(guó)Santa Cruz公司）1 h，孵育，TBST再?zèng)_洗，加入化學(xué)發(fā)光劑顯影（美國(guó)Thermo公司）。

1.2.3 ELISA

Shh的ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，檢測(cè)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 重組Shh作用于AR42J細(xì)胞對(duì)Shh信號(hào)通路的影響

不同濃度即0，0.5，1，2 μg/mL的重組Shh（rShh）誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)Shh及其下游信號(hào)分子Gli1和Ptch1的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

不同濃度的雨蛙素刺激胰腺AR42J細(xì)胞后，Hh信號(hào)的3個(gè)亞基Shh，Ihh，Dhh的mRNA表達(dá)水平都有不同程度的增加，且呈濃度依賴性，濃度為3 μM時(shí)升高最明顯。3個(gè)亞基中，Shh表達(dá)最明顯（圖1-A）。

注：A不同濃度的雨蛙素刺激AR42J細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)Hedgehog亞基的mRNA變化，3個(gè)亞基都有不同程度升高，Shh升高最明顯

2.2 Western-blot檢測(cè)Shh蛋白水平

進(jìn)一步檢測(cè)表達(dá)最明顯的Shh，發(fā)現(xiàn)和基因檢測(cè)結(jié)果相似，Shh蛋白水平呈濃度依賴的升高，雨蛙素濃度在3 μM時(shí)蛋白水平最高(圖1-B）。

圖1 RT-PCR和Western-blot檢測(cè)Hedgehog的3個(gè)亞基

2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清Shh水平

不同濃度的雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞上清液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與無(wú)雨蛙素刺激的正常AR42J細(xì)胞相比，雨蛙素刺激后，可溶性的Shh水平呈劑量依賴性的增加，3 μM時(shí)水平最高(圖2）。

圖2 ELISA檢測(cè)Shh表達(dá)

2.4 RT-PCR檢測(cè)Shh信號(hào)通路相關(guān)分子

為了探討是否可溶性的Shh能激活Shh信號(hào)通路，在正常培養(yǎng)的AR42J細(xì)胞加入不同濃度的重組Shh（rShh）蛋白刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shh，Gli1和Ptch1表達(dá)都明顯升高，也呈濃度依賴性RT-PCR檢測(cè)Shh信號(hào)通路分子mRNA表達(dá)（圖3）。

圖3 重組rShh劑量依賴地促進(jìn)Shh、下游Gli1和Ptch1分子表達(dá)

3 討論

Hedgehog（Hh）信號(hào)分子是從果蠅體內(nèi)分離的一種分節(jié)極性基因，哺乳動(dòng)物和其他生物都廣泛存在，主要由Hh配體Desert Hedgehog（Dhh），Sonic Hedgehog（Shh），Indian Hedgehog（Ihh）、兩個(gè)膜受體Patched(Ptch)、Smoothened(Smo)及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli家族(Gli1,Gli2,Gli3)組成，在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、器官形成、損傷修復(fù)和腫瘤等生理和病理過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用[3]。

研究表明，Hedgehog-Gli信號(hào)通路與胰腺關(guān)系密切。在胰腺發(fā)育過(guò)程中,Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控胰腺的正常發(fā)育,胰島細(xì)胞、胰腺形態(tài)的發(fā)生都與之相關(guān)，在正常的成熟胰腺組織中無(wú)表達(dá)或僅輕度表達(dá)[4]。Hh表達(dá)的異常與胰腺慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。而Hh信號(hào)是否參與急性胰腺炎（AP）的發(fā)病過(guò)程卻少見(jiàn)報(bào)道。我們前期的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，Shh在小鼠AP模型中表達(dá)明顯升高。當(dāng)前的研究即是進(jìn)一步從體外模型探討Shh在AP的表達(dá)變化。

目前公認(rèn)AP發(fā)病機(jī)制是胰腺腺泡細(xì)胞中胰蛋白酶原被提前過(guò)度激活，說(shuō)明胰腺腺泡細(xì)胞中在AP中起始動(dòng)作用。大鼠AR42J胰腺腺泡細(xì)胞系具有胰腺腺泡細(xì)胞的絕大多數(shù)功能，而成為進(jìn)行AP體外實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系。我們用不同濃度雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞成功構(gòu)建體外AP模型，首先探討Hh的3個(gè)亞基的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)亞基Dhh，Shh，Ihh的mRNA表達(dá)不同程度的增加，且呈濃度依賴性增加，其中，Shh表達(dá)最明顯。說(shuō)明，AP發(fā)病過(guò)程中，Hh信號(hào)的亞基中，Shh是主要的參與者。我們進(jìn)一步檢查Shh蛋白水平，發(fā)現(xiàn)和基因水平相似，Shh蛋白水平也隨雨蛙素濃度的增加而升高。由于Shh是一個(gè)分泌因子，為了探討是否Shh上調(diào)與AR42細(xì)胞自分泌Shh有關(guān)，雨蛙素誘導(dǎo)細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)了細(xì)胞上清，發(fā)現(xiàn)可溶性的Shh水平呈劑量依賴性的增加。證實(shí)雨蛙素誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞后，細(xì)胞自分泌Shh增加參與AP的發(fā)病過(guò)程。

為了探討是否可溶性的Shh能激活Shh信號(hào)通路，我們?cè)谡Ｅ囵B(yǎng)的AR42J細(xì)胞加入不同濃度的重組Shh（rShh）蛋白刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shh，Gli1和Ptch1表達(dá)都呈濃度依賴性明顯升高。說(shuō)明可溶性的Shh可以激活Shh-Gli1-Ptch1信號(hào)軸，胰腺腺泡細(xì)胞是Shh信號(hào)通路的重要靶細(xì)胞。

有關(guān)Shh在急性胰腺炎癥損傷過(guò)的具體作用，當(dāng)前的研究無(wú)法證實(shí)。我們前期通過(guò)體內(nèi)加入Hh的拮抗劑Cyclopamine，已經(jīng)初步證實(shí)Shh可能起保護(hù)性的作用，具體的機(jī)制不清楚[2]?；仡櫸墨I(xiàn)，在組織急性炎癥損傷過(guò)程中，Hh可能主要起保護(hù)性的作用，包括緩解缺氧，對(duì)抗氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡等。Agouni等[6]發(fā)現(xiàn)微粒攜帶的Shh可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，促發(fā)NO信號(hào)相關(guān)的酶磷酸化和活化表達(dá)，減少反應(yīng)性氧化物質(zhì)的產(chǎn)生。相應(yīng)的，特異性地抑制PI3激酶和ERK信號(hào)，Shh微粒的作用被抑制。在急性內(nèi)皮損傷過(guò)程中，微粒攜帶的Shh是一種對(duì)抗內(nèi)皮功能失衡的新手段。在肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程，以及脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中，Shh可能是通過(guò)介導(dǎo)NO信號(hào)起保護(hù)性的作用[7,8]。Ji等證實(shí)大鼠腦缺血過(guò)程中，Shh通過(guò)提高超氧化物歧化酶(SOD1)活性，保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗氧化應(yīng)激，從而減輕缺血性腦損傷[9,10]。

當(dāng)前的研究證實(shí)，Shh以自分泌的方式激活Shh-Gli1-Ptch1參與了急性胰腺炎的分子病理過(guò)程。我們推測(cè)，Shh可能在急性胰腺炎癥損傷中起保護(hù)性的作用，接下來(lái)的研究，需要調(diào)控Shh信號(hào)，深入探討具體的分子機(jī)制。

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（2015-09-08收稿）

Potential roles of autocrine Shh signal in caerulein-induced acute pancreatitis

Zhou Xiangyu1,Chen Xia2,Huang Juan3,Zeng Fancai41Department of Vascular and Thyroid Surgery,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,2Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,3Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,4Department of Cell and Biochemistry,Sichuan Medical University，Lu zhou 646000,Sichuan province,China

Objective：To investigate the potential roles of Hedgehog signal in caerulein-induced acute pancreatitis.Methods：Different doses of caerulein were used to induce acute pancreatitis in pancreatic acinar cell lines,AR42J.Cells and conditioned medium were collected after 24 hours.The expression of Shh was detected by RT-PCR and Western-blot respectively,and levels of Shh in conditioned medium were measured by ELISA.After treatment of AR42J cells with recombinant Shh N-terminal peptide,the expression of the hedgehog signaling components,Shh,Gli1,and Ptch1 were evaluated by RT-PCR.Results：Caerulein induced expression of Shh at both mRNA and protein levels in pancreatic AR42J cell lines in a dose dependent manner,so did the soluble Shh in the conditioned medium.Recombinant Shh stimulated the expression of the hedgehog signaling components,Shh,Gli1,and Ptch1.Conclusion：Caerulein up-regulated the expression of Shh in AR42J cells, and recombinant Shh stimulated the expression of hedgehog signaling components,Shh,Gli1,and Ptch1, suggesting autocrine Shh signal may contribute to the pathogenesis of acute pancreatitis.

Caerulein;AR42J;Acute pancreatitis;Sonic Hedgehog

Q576

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.001

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No：81100272），四川省科技廳基金資助項(xiàng)目（No：2014JY0004）

周翔宇（1977-），男，副教授，博士。E-mail：xiangyuzhou971@126.com