周本宏易慧蘭王耀華張 嬋凃 杰

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072

地榆中總鞣質(zhì)超聲提取工藝研究

周本宏1，2易慧蘭1王耀華1張 嬋2凃 杰2

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072

目的：優(yōu)選地榆中鞣質(zhì)最佳提取工藝。方法：以提取物中總鞣質(zhì)含量為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究提取溶劑、料液比、超聲提取時(shí)間、超聲提取次數(shù)等四個(gè)因素對(duì)總鞣質(zhì)提取率的影響，利用正交試驗(yàn)確定地榆總鞣質(zhì)最佳提取工藝。結(jié)果：地榆鞣質(zhì)的最佳提取工藝為：12倍量的40%的乙醇，超聲提取2次，每次75min。在最佳條件下，提取率為9.113%。結(jié)論：該工藝合理可行，重復(fù)性好，地榆鞣質(zhì)的提取率高。

地榆；鞣質(zhì)；超聲提?。徽辉囼?yàn)

地榆來(lái)源于薔薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）或長(zhǎng)葉地榆［Sanguisorba officinalis L.var.Longifolia（Bert.）Yǘet Li］的干燥根，有涼血止血、解毒斂瘡之功效，用于便血、痔血、水火燙傷，其炮制品已應(yīng)用于臨床。地榆含有多種化學(xué)成分，主要為鞣質(zhì)、皂苷、黃酮類化合物，其中鞣質(zhì)是主要的活性成分［1］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，地榆鞣質(zhì)能收縮血管，縮短凝血時(shí)間［2］，在抗腫瘤［3］、提高免疫力［4］等方面都有較好療效。

中藥中鞣質(zhì)的提取常采用滲漉、浸漬、熱回流等方法，這些方法有一些缺點(diǎn)，如浸漬法、滲漉法提取時(shí)間長(zhǎng)，不適合大量生產(chǎn)，而熱回流法對(duì)熱不穩(wěn)定成分不宜使用。超聲提取法近年來(lái)得到很大發(fā)展，它利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度、空化現(xiàn)象［5］等效應(yīng)，加速目標(biāo)物進(jìn)入溶劑，縮短提取時(shí)間，節(jié)省有機(jī)溶劑，且適合熱敏性及氧化分解成分的提取［6］。本試驗(yàn)采用超聲提取法，以鞣質(zhì)提取率為指標(biāo)，運(yùn)用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)鞣質(zhì)提取影響因素進(jìn)行考察，優(yōu)化提取條件，為地榆鞣質(zhì)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV－1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（SHIMADZU CORPORATION）；HX1002T電子天平（慈溪市天東衡器廠）；TYS－100型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）。

1.2 試藥 生地榆飲片 （購(gòu)于湖北盛德堂中藥飲片有限公司，由武漢大學(xué)張洪教授鑒定，且符合 《中國(guó)藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST－13040103，成都曼斯特生物科技有限公司）；干酪素 （北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司）；磷鉬鎢酸 （自制）；水為雙蒸水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鞣質(zhì)含量測(cè)定［7］

2.1.1 溶液制備 ①磷鉬鎢酸試液：取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25g，加水700ml，使溶解，加鹽酸100ml、磷酸50m l，加熱回流10h，加硫酸鋰150g，水50m l，溴0.2m l，煮沸除去多余的溴，放冷，加水稀釋至1000m l，過(guò)濾，即得。②29%碳酸鈉試液：取無(wú)水碳酸鈉145g，加水溶解，定容至500m l，即得。③對(duì)照品溶液：精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品12.5mg，置25m l棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5m l，至50ml棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml中含有沒(méi)食子酸0.05mg）。④供試品溶液：取樣品液濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml置100ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0m、3.0、4.0、5.0m l，分別置25ml棕色容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1ml，再分別加入水11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0ml，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外－可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VA）在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度 （Y）為縱坐標(biāo)，檢測(cè)濃度 （X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)線性回歸，得回歸方程為Y＝96.093X＋0.0339，R2＝0.9995。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸在1.0～10.0μg／m l范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.3 含量測(cè)定 總酚量：精密吸取供試品溶液0.5m l，置25ml棕色量瓶中，照2.1.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品中沒(méi)食子酸的量 （mg），即得。

不被吸附的多酚量：精密量取供試品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的具塞錐形瓶中，置30℃水浴中保溫1h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，過(guò)濾，精密取續(xù)濾液0.5m l，置25ml棕色量瓶中，按上述方法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品中沒(méi)食子酸的量 （mg），即得。

鞣質(zhì)含量計(jì)算：鞣質(zhì)的量 （mg）＝總酚量－不被吸附的多酚量

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取溶劑對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5g經(jīng)粉碎后干燥的地榆粉11份，精密稱定，分別加入10倍量的20%、30%、40%、60%、80%乙醇；20%、40%、60%、70%、80%丙酮及水，浸泡1h，室溫，超聲提取60min，過(guò)濾，濾液定容至250ml為樣品液。按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算鞣質(zhì)含量 （鞣質(zhì)含量＝總鞣質(zhì)質(zhì)量／地榆質(zhì)量× 100%），結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知：當(dāng)乙醇濃度為30%時(shí)，鞣質(zhì)提取率最高，乙醇濃度超過(guò)30%時(shí)，提取率有所下降；鞣質(zhì)提取率隨著丙酮濃度的升高而升高，在70%處達(dá)到最大，繼續(xù)升高丙酮濃度，提取率有下降趨勢(shì)，這可能是由于有機(jī)相濃度增加使鞣質(zhì)的極性減弱不利于鞣質(zhì)的溶出所致。由于鞣質(zhì)提取率在30%乙醇和70%丙酮中提取率相差不大，又考慮到價(jià)格、環(huán)境及毒性，因此，提取溶劑為30%乙醇溶液較好。2.2.2 料液比對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5g經(jīng)粉碎后干燥的地榆粉，6份，分別加入5、8、10、12、15、20倍量30%乙醇，浸漬1h，室溫，超聲提取60min，過(guò)濾，濾液定容至250ml為樣品液。按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算鞣質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知：隨著料液比增大，鞣質(zhì)提取率升高，料液比為1∶10時(shí)提取效果最佳，而當(dāng)大于1∶10時(shí)幾乎保持不變，因此，料液比在1∶10左右為宜。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5g經(jīng)粉碎后干燥的地榆粉，5份，加入10倍量30%乙醇溶液，浸漬1h后，分別超聲提取30、45、60、75、90min，過(guò)濾，濾液定容至250ml為樣品液。按上述方法測(cè)定，計(jì)算鞣質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知：提取率隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)而升高，60min時(shí)提效果最佳，但隨著超聲時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，提取率反而有所下降，可能是由于超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切力，長(zhǎng)時(shí)間的作用會(huì)使得鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞而影響提取率，因此，提取時(shí)間以60min左右為宜。

2.2.4 超聲提取次數(shù)對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5g精粉粹后干燥的地榆粉，加入10倍量30%的乙醇溶液，浸漬1h后，分別超聲提取1、2、3、4次，每次60min，過(guò)濾，濾液定容至250ml為樣品液。按上述方法測(cè)定，計(jì)算鞣質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖2－5。由圖5可知：提取次數(shù)對(duì)提取率有一定影響，提取3

次后，地榆中鞣質(zhì)已基本提取完全，再增加提取次數(shù)，提取率無(wú)顯著增加，因此，以提取3次為宜。

2.3 正交試驗(yàn)

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選取乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為主要考察因素 （表1），采用4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)方案（表2），并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn) （表3），確定地榆總鞣質(zhì)最佳提取工藝。

表2 正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以鞣質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)直觀分析可知，影響鞣質(zhì)提取效率的因素順序是D＞C＞A＞B，最佳提取工藝條件為A3B3C3D2，即40%的乙醇，超聲提取75min，料液比1∶12，提取2次。經(jīng)方差分析可知，提取次數(shù)對(duì)超聲提取工藝有一定影響（P＜0.10），溶劑濃度、超聲時(shí)間和料液比對(duì)提取效果影響較小。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證 按正交試驗(yàn)結(jié)果，取地榆粉5g，加入12倍量40%乙醇溶液，浸漬1h，超聲提取75min，提取2次，過(guò)濾，合并濾液并定容至250ml為樣品液。按上述方法測(cè)定，計(jì)算鞣質(zhì)含量，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明總鞣質(zhì)含量分別9.207%、9.176%和8.957%，平均含量為9.113%。

3 討論

研究根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XB設(shè)計(jì)了鞣質(zhì)含量測(cè)定方法，以沒(méi)食子酸作對(duì)照品，采用紫外－分光光度法測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以地榆根為原料，將提取物中總鞣質(zhì)的含量作為指標(biāo)，通過(guò)單因素的考察確定每個(gè)因素的三個(gè)條件，以正交實(shí)驗(yàn)方法確定最佳提取工藝為12倍量的40%乙醇，浸漬1h，超聲提取2次，每次75min，經(jīng)驗(yàn)證表明該工藝穩(wěn)定可行。由于鞣質(zhì)具有不穩(wěn)定，極性強(qiáng)的特點(diǎn)，該工藝在室溫下提取，且提取率高，時(shí)間短，有利于下一步鞣質(zhì)的分離及純化，對(duì)鞣質(zhì)的進(jìn)一步加工有很好的指導(dǎo)意義。

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［6］李紅然，付大友.五倍子中有效成分提取方法研究進(jìn)展 ［J］.廣東化工，2010，37（10）：71.

［7］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典 （一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99.

Optim ization of Extraction Process of Total Tannins in Sanguisorba officinalis L

ZHOU Ben-hong1，2YIHui-lan1WANG Yao-hua1ZHAN Chan2TU Jie2
1.Renmin Hospital ofWuhan University，Wuhan 430060，China；2.Pharmaceutical College ofWuhan University，Wuhan 430072，China

Objective To optimize the extraction process of total tannins in Sanguisorba officinalis L.M ethods Using total tannins as the index，the effect factors to extraction rate including solvent，ratio of solid to liquid，ultrasonic extraction time and ultrasonic frequency were investigated by single factor test，and the optimal conditions of extraction were obtained by orthogonal test.Result The extraction rate of total tannins in Sanguisorba officinalis L.was 9.113%under the optimal extracting conditions ethanol 40%，ratio of material to liquid 1∶12，extraction time 75 min and extracting for 2 times.Conclusion This extraction process is reasonable，feasible，repeatability and high rate of extraction.

Sanguisorba officinalis L.；Tannins；Ultrasonic extraction；Orthogonal test

R284.2

A

1007－8517（2015）01－0027－03

2014.10.09）

周本宏（1964－），男，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥及天然藥物活性成分研究。E－mail：benhongzh＠whu.edu.cn