葉有標(biāo) 祝子銅 章應(yīng)俊 劉國群

摘 要：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立測定不同狀態(tài)的蜂王漿中4種四環(huán)素族抗生素殘留量的測定方法。蜂王漿樣品試樣中四環(huán)素族藥物殘留量用0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取，經(jīng)過濾和離心后，上清液用PLS固相萃取柱凈化，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)峰面積法定量。4種藥物基本實現(xiàn)分離以及定性定量。蜂王漿中四環(huán)素藥物殘留的測定低限（LOQ）為10 μg/kg，線性范圍為10～50ng/mL?；厥章示?8.0%～102.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于20%。土霉素、四環(huán)素，金霉素、強力霉素的檢測限為10μg/kg。該方法靈敏、可靠，可用于不同狀態(tài)蜂王漿中4種四環(huán)素類抗生素的同時檢測。

關(guān)鍵詞：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 蜂王漿 四環(huán)素類抗生素

中圖分類號：R9781 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）03（c）-0018-01

該文采用高效液相色譜法和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法對不同狀態(tài)的蜂王漿的檢測分析技術(shù)研究，期建立一種能符合對不同狀態(tài)的蜂王漿的檢測的技術(shù)，確保測試結(jié)果準(zhǔn)確性。為蜂產(chǎn)品檢測四環(huán)素類抗生素提供技術(shù)支持。通過系列實驗結(jié)果表明，該方法能滿足蜂王漿產(chǎn)品檢測需求。

1 實驗部分

1.1 安全提示

本方法在樣品處理時，應(yīng)戴上防護(hù)手套避免甲醇、甲酸對身體的傷害。若濺到皮膚和眼睛，應(yīng)立即用大量清水沖洗，情況嚴(yán)重者應(yīng)盡快到醫(yī)院治療。

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧（ESI）離子源、渦旋振蕩器、離心機：轉(zhuǎn)速≥4000 r/min、聚丙烯具塞塑料離心管：50 mL、

分析天平：感量0.0001 g、移液槍：50 μL、200 μL、1000 μL、一次性滴管、固相萃取裝置、玻璃離心管：10 mL、氮吹儀、微孔濾膜，0.45 μm、0.2 μm、PH計。

1.3 試劑與材料

有機溶劑為HPLC級、乙二胺四乙酸二鈉等為分析純、流動相HPLC級。

1.4 原理

試樣中四環(huán)素族藥物殘留量用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取，經(jīng)過濾和離心后，上清液用PLS固相萃取柱凈化，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)峰面積法定量。

2 試樣

（1）試樣制備將抽取的樣品充分混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈的容器中，密封、標(biāo)記、-18℃冷凍保存，以備測試。

（2）提?。悍Q取試樣2 g（精確至0.01g），置于50 mL具塞塑料離心管，加入濃度為100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，在加標(biāo)樣品中加入濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，加入5 mL0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液和5mL甲醇漩渦混合1min，6000r/min離心5 min，合并上清液與50 mL容量瓶中，再分兩次用約10 mL0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水超聲提取兩次，每次漩渦混合1 min，6000 r/min離心5 min，合并上清液，并定容至50 mL，混勻，取25 mL溶液至離心管用PH計調(diào)節(jié)pH至6.0。

（3）凈化：將上述樣品溶液加至已活化的PLS柱，待樣液完全流出后，依次用6 mL水和6 mL甲醇：水（1：19）淋洗，棄去全部流出液。2.0 kPa以下減壓抽干5min，最后用10 mL甲醇洗脫。將洗脫液氮吹濃縮至干（溫度低于40 ℃），用1.0 mL甲醇：水=1：9（含0.15%甲酸）溶解殘渣，過0.45 um濾膜，待測定。

3 儀器參數(shù)與測定條件

3.1 色譜測定條件

（1）色譜柱：Eclipse Plus C18， 3.5μm，2.1×100 mm（內(nèi)徑）。（2）梯度洗脫條件。（3）流速：0.25 mL/min。（4）進(jìn)樣量：20 μL。（5）柱溫：40℃f）流動相：A：0.3%甲酸 B：乙腈表 梯度洗脫條件。

3.2 定量方法

用色譜工作站建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，樣品采用工作曲線定量。

3.3 樣品加標(biāo)回收率實驗

蜂王漿中四環(huán)素測定的回收率范圍和精密度（n=6檢測限、測定低限、線性范圍、回收率范圍和精密度。本方法對于蜂王漿中四環(huán)素藥物殘留的測定低限（LOQ）為10 μg/kg，線性范圍為10～50.0 ng/mL。

4 結(jié)果計算

按式（1）計算試樣中含量。

（1）

式中：

X—試樣中的殘留量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

C—由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到樣液中的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V—樣液最終體積，單位為毫升（mL）；

m—最終樣液所代表的試樣量，單位為克（g）。

4.1 檢測質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)控樣品為空白樣品添加，添加水平為0.5 μg/kg，回收率范圍為80%～110%。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液線性范圍為4～50.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)大于0.88。稱取5g（精確到0.01 g）蜂王漿空白樣品，加入濃度100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，按照上述實驗方法，測定添加樣品中四環(huán)素的含量。空白溶液及其添加50 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液所得色譜圖。

5 結(jié)論

針對不同狀態(tài)的蜂王漿（干粉和鮮王漿）采用高效液相色譜法和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法對四環(huán)素類抗生素檢測，得出如下結(jié)論。

該方法可以用于干粉和鮮王漿中四環(huán)素類抗生素及代謝物檢測，回收率88.0%～102.0%，目標(biāo)代謝物有良好的回收率。

對不同狀態(tài)的蜂王漿的檢測，本方法對于蜂王漿中四環(huán)素藥物殘留的測定低限（LOQ）為10 μg/kg，線性范圍為10 μg/mL～50.0 μg/mL，符合產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)要求。

該方法具有較高靈敏度，適用相對較廣，檢測時間，前處理簡便。

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