林雅寧,董 劍，徐忠玉(中國人民解放軍第一七五醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建漳州 363000)

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·論 著·

結(jié)核分枝桿菌去乙?；?的克隆及酶學(xué)研究

林雅寧,董 劍，徐忠玉(中國人民解放軍第一七五醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建漳州 363000)

目的 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌去乙酰化酶2(Sir2)原核表達(dá)載體，并進(jìn)行表達(dá)純化及酶學(xué)研究。方法 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增Sir2基因，構(gòu)建pET-28a-Sir2重組質(zhì)粒，在E.coli BL2(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，經(jīng)Ni2+-NTA柱純化，最后通過去乙?；冈囼?yàn)測定Sir2酶活的最適反應(yīng)溫度和pH值，以及吡嗪酰胺對(duì)其酶活的影響。結(jié)果 成功構(gòu)建了Sirt2原核表達(dá)載體，并能在E.coli BL21(DE3)中高效表達(dá)。隨后對(duì)純化的Sir2蛋白進(jìn)行依賴于NAD+的去乙?；钚匝芯?，得到該酶的最適反應(yīng)溫度是25 ℃，最適反應(yīng)pH值是9.0。在偏酸性環(huán)境中，吡嗪酰胺對(duì)酶活有抑制，而在偏堿性環(huán)境中，沒有抑制作用。結(jié)論 利用分子克隆技術(shù)，獲得了高純度的Sir2蛋白并獲得其酶活最適反應(yīng)溫度和最適pH值，及吡嗪酰胺對(duì)其有抑制效果，為研究抗結(jié)核藥物吡嗪酰胺的抑菌機(jī)制提供一定基礎(chǔ)。

結(jié)核分枝桿菌； 去乙酰化酶； 基因克隆； 蛋白純化； 吡嗪酰胺

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)是目前全球最可怕的流行性致病菌之一，結(jié)核病在我國的發(fā)病率呈回升趨勢[1-3]。隨著化療藥物的廣泛應(yīng)用，結(jié)核桿菌的耐藥率日趨上升，特別是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)，給結(jié)核病的控制工作帶來巨大困難[4-5]。因此，尋找一種有效的藥物靶標(biāo)分子的任務(wù)迫在眉睫。去乙?；?Sir2)蛋白是一類依賴于NAD+的去乙?；福诩?xì)胞的長壽與衰老、基因沉默、凋亡等生理活動(dòng)中具有十分重要的調(diào)節(jié)作用[6]。近年來Li發(fā)現(xiàn)了Sir2參與了分枝桿菌的非同源末端連接修復(fù)[7]。Sir2抑制p53蛋白的乙酰化，從而抑制依賴于p53蛋白的細(xì)胞凋亡，使DNA損傷修復(fù)有更充裕的時(shí)間[8]。Sir2蛋白具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性和依賴于NAD的去乙?；?。煙酰胺是Sir2家族蛋白的天然抑制物，早期研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺對(duì)結(jié)核菌有良好的抑制效果，因此，作者猜測PZA的作用機(jī)制可能與Sir2有關(guān)[9-10]。本文克隆表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的Sir2蛋白，對(duì)它的去乙酰酶活進(jìn)行鑒定，并檢測PZA對(duì)其抑制效果，期望通過對(duì)結(jié)核分枝桿菌Sir2蛋白的研究，能為抗結(jié)核病藥物PZA的作用機(jī)制和耐藥機(jī)制提供新線索，為結(jié)核新藥的設(shè)計(jì)和篩選提供靶標(biāo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)核分枝桿菌H37Rv由漳州疾控中心贈(zèng)送，用于克隆、表達(dá)的質(zhì)粒pET28a，大腸桿菌菌株E.coli BL21(DE3)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與試劑 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購自美國ABI，Ni2+-NTA樹脂購自Novagen公司，電泳裝置購自BIO-RAD公司，熒光光度計(jì)購自Bio-TEK公司。DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均為Takara公司產(chǎn)品。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，底物Boc-lys(Ac)-AMC為Omega公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 Sir2基因的擴(kuò)增和克隆 從Genebank中獲得結(jié)核分枝桿菌的Sir2(Rv1151c)基因的全核苷酸序列714 bp，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，上游引物：5′-TACTCCATGGTTATGCGAGTGGCGGTGCTCA-3′和下游引物：5′-ATTAGACTCCTATTTCAGCAGGGCGGGCA-3′。在上下游引物中分別引入酶切位點(diǎn)NcoⅠ和SacⅠ。PCR擴(kuò)增循環(huán)條件為：95 ℃ 5 min，一個(gè)循環(huán)；95 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)；最后72 ℃延伸7 min?；騊CR擴(kuò)增后瓊脂糖凝電泳回收目標(biāo)條帶，膠回收后產(chǎn)物用NcoⅠ和SacⅠ雙酶切消化后與載體pET-28a進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化入E.coli BL21得到E.coli BL21/pET-28a-Sir2，經(jīng)過表達(dá)驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證或PCR驗(yàn)證后進(jìn)行全基因測序。

1.3.2 Sir2的表達(dá)和純化 重組菌株在相應(yīng)的抗菌藥物L(fēng)B培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后接種于新鮮的LB中，OD600為0.5時(shí)加入0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導(dǎo)10 h。利用Ni2+-NTA親和層析柱純化蛋白。SDS-PAGE檢測純度，濃度用Bio-Rad公司生產(chǎn)的蛋白質(zhì)濃度測定。

1.3.3 Sir2依賴于NAD+的去乙酰化酶活性 本試驗(yàn)利用乙?；療晒獾孜顱oc-lys(Ac)-AMC和NAD+作為反應(yīng)底物測定依賴于NAD+的去乙酰化酶活性。測定酶活的反應(yīng)體系組成：20 mmol/L Tris-HCl緩沖 (pH8.0)，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L KH2PO4，250 mmol/L EDTA，500 μmol/L NAD+，20 μmol/L 熒光底物，20 μg His-Sir2重組酶，以不加入NAD+和不加入酶的反應(yīng)作為陰性對(duì)照。進(jìn)行酶反應(yīng)條件優(yōu)化，以獲得較佳的酶反應(yīng)條件。反應(yīng)混合物避光靜置，于一定恒溫反應(yīng)2 h。終止反應(yīng)：加入60 μg/mL胰蛋白酶，37 ℃保持30 min。然后使用酶標(biāo)儀測定熒光值(激發(fā)光340;發(fā)射光460)。PZA抑制試驗(yàn)：在上述反應(yīng)體系內(nèi)，加入梯度濃度的已知PZA。反應(yīng)混合物避光靜置，于25 ℃恒溫反應(yīng)2 h，然后加入終止緩沖液，于37 ℃反應(yīng)30 min，測定熒光(激發(fā)光340;發(fā)射光460)。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)核分枝桿菌Sir2表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證 從結(jié)核分枝桿菌基因組中PCR擴(kuò)增出全長714 bp的Sir2基因片段，通過基因工程連接到pET-28a載體中，酶切驗(yàn)證后進(jìn)行全基因測序，見電泳圖1。

注：泳道M，DNA Marker DL 2000 plus;泳道1，重組質(zhì)粒pET-28a-Sir2;泳道2，重組質(zhì)粒pET-28a-Sir2 NcoⅠ和SacⅠ雙酶切。

圖1 pET-28a-Sir2重組質(zhì)粒的鑒定

2.2 結(jié)核分枝桿菌Sir2的表達(dá)及純化 對(duì)表達(dá)菌株E.coli BL21/pET-28a-Sir2先進(jìn)行了Sir2蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化和可溶性分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在表達(dá)時(shí)形成大量包涵體。通過摸索發(fā)現(xiàn)，在0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導(dǎo)下，有利于形成可溶性蛋白，因此，采取該條件進(jìn)行該蛋白的大量表達(dá)。經(jīng)過特異親和層析，獲得純的Sir2蛋白見圖2，目的條帶約30×103。

2.3 Sir2依賴于NAD+的去乙?；富钚詼y定 首先用熒光法測Sir2蛋白依賴于NAD+的去乙?；钚浴＝Y(jié)果顯示，陰性對(duì)照值熒光強(qiáng)度范圍在50左右，而添加了His-Sir2重組酶的熒光值在1 000左右，說明Sir2確實(shí)具有依賴于NAD+的去乙?；钚浴?/p>

注：泳道M，蛋白 Marker；泳道1，pET-28a菌株對(duì)照;泳道2，pET-28a-Sir2重組子；泳道3，純化的Sir2蛋白。

圖2 SDS-PAGE分析Sir2蛋白

2.3.1 最適合反應(yīng)溫度和pH值 測定了不同溫度和pH條件下Sir2的去乙酰化酶活性。結(jié)果顯示，25 ℃下Sir2蛋白的酶活力最強(qiáng)，見圖3。最適pH值試驗(yàn)表明，pH<7時(shí)隨著pH降低，酶活逐漸降低；pH>7時(shí)，隨著pH的升高，活力逐步加強(qiáng)，在pH 9左右達(dá)到頂峰，最適反應(yīng)pH值為9，見圖4。

圖3 Sir2酶活最適反應(yīng)溫度曲線

圖4 Sir2酶活最適反應(yīng)pH值曲線

2.3.2 PZA抑制試驗(yàn) 在偏酸性(pH5.5)環(huán)境和偏堿性環(huán)境(pH8.0)中測定不同濃度PZA對(duì)Sir2酶活的影響。在偏堿性條件PZA對(duì)Sir酶活沒有抑制效果；偏酸性條件，PZA表現(xiàn)出抑制活性，但抑制強(qiáng)度弱，600 μmol/L濃度下酶活力仍保持80%，且隨著濃度增大抑制效果增強(qiáng)不明顯。

3 討 論

Sir2蛋白是一類依賴于NAD+的去乙?；福男蛄袕脑松锏秸婧松锒己鼙Ｊ?但不同物種間Sir2蛋白還是會(huì)存在差異[11-12]。結(jié)核桿菌Sir2基因GC水平達(dá)到66.80%。外源表達(dá)條件下容易產(chǎn)生包涵體，這可能與大腸菌內(nèi)缺乏輔助結(jié)核菌Sir2折疊的分子伴侶有關(guān)。本研究通過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，最后在OD600為0.5時(shí)加入0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導(dǎo)10 h，蛋白可溶性提高，有利于蛋白質(zhì)的純化和保持生物學(xué)功能。本研究證明了結(jié)核分枝桿菌Sir2蛋白是依賴于NAD+的去乙?；福浠钚詫?duì)溫度和pH值是敏感的。37 ℃左右酶失去大部分活性，而37 ℃本是結(jié)核菌在人畜體內(nèi)生存時(shí)的實(shí)際環(huán)境溫度，原因可能是體外反應(yīng)條件不足以完全恢復(fù)其在體內(nèi)的活力。

PZA是一種重要的抗結(jié)核菌藥物，對(duì)處于酸性環(huán)境中緩慢生長的吞噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌來說，PZA是目前最佳殺菌藥物。在體內(nèi)它并非直接作用于病菌，而是依靠病菌自身的吡嗪酰胺酶將其活化成為吡嗪酸，才能起作用，但是其作用靶點(diǎn)至今不明確。本研究發(fā)現(xiàn)偏堿性條件PZA對(duì)Sir酶活沒有抑制效果；偏酸性條件，PZA表現(xiàn)出弱的抑制活性。

總之，本試驗(yàn)構(gòu)建了結(jié)核菌的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件最后純化到該蛋白，試驗(yàn)也證明了Sir2具有去乙?；富钚?，最適反應(yīng)溫度是25 ℃，pH9.0，偏酸性環(huán)境中PZA對(duì)其有較弱的抑制作用。本研究表明吡嗪酰胺的作用機(jī)制可能與Sir2有關(guān)。

[1]Watts G.WHO annual report finds world at a crossroad on tuberculosis[J].BMJ，2012,345(1):7051-7061.

[2]吳雪瓊，張宗德，樂軍.分枝桿菌分子生物學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2010:131-132.

[3]劉劍君,幺鴻雁.我國結(jié)核病的流行現(xiàn)狀和防治對(duì)策[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,2006,12(5):638-640.

[4]Le Chevalier F,Cascioferro A,Majlessi L,et al.Mycobacterium tuberculosis evolutionary pathogenesis and its putative impact on drugdevelopment[J].Future Microbiol,2014,9(1):969-985.

[5]Drusano GL,Neely M,Van Guilder M,et al.Analysis of combination drug therapy to develop regimens with shortened duration of treatment fortuberculosis[J].PLoS One，2014,9(7):311-321.

[6]Sharma A,Costantini S,Colonna G.The protein-protein interaction network of the human Sirtuin family[J].Biochim Biophys Acta,2013,1834(10):1998-2009.

[7]Li Z,Wen J,Lin Y,et al.A Sir2-like protein participates in Mycobacterial NHEJ[J].PLoS One,2011,79(2):316-330.

[8]Cohen HY,Lavu S,Bitterman KJ,et al.Acetylation of the C terminus of Ku70 by CBP and PCAF controls Bax-mediated apoptosis[J].Mol Cell,2004,13(5):627-638.

[9]Huant E.French priority in the discovery of the antituberculous action of nicotinic compounds[J].Therapie,1952,7(4):371-376.

[10]De Simoni G,Spina G,Zorini AO.Possible therapeutic use of new preparations with antituberculous action(pyrazinamide and cycloserine);preliminary note[J].Minerva Med,1956,47(80):973-980.

[11]Brachmann CB,Sherman JM,Devine SE,et al.The Sir2 gene family,conserved from bacteria to humans,functions in silencing,cell cycle progression,and chromosome stability[J].Genes Dev,1995,9(23):2888-2902.

[12]Hou B,Liu X,Zheng F,et al.Molecular cloning,modeling and differential expression of a gene encoding a silent information regulator-like protein from Sporothrix schenckii[J].Int J Mol Med,2014,33(6):1415-1422.

Study on cloning and enzymology of deacetylase protein Sir2 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv

LINYa-ning,DONGJian,XUZhong-yu

(DepartmentofClinicalLaboratory,175HospitalofPLA/AffiliatedDongnanHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou,Fujian363000,China)

Objective To construct the deacetylase protein Sir2 prokaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis(MTb) and to conduct the expression purification and enzymologic study.Methods Sir2 gene was amplified from MTb H37Rv genomic DNA as the template by PCR and then the recombinant plasmid pET-28a-Sir2 was constructed.The expression protein was induced in E.coli BL2(DE3) and purified by Ni2+-NTA afinity chromatography.Finally the optimal reaction temperature and pH value of Sir2,and influence of pyrazinamide(PZA) on enzyme activity were detected by the acetylation enzyme test.Results Sir2 prokaryotic expression vector was successfully constructed and could be highly expressed in E.Coli BL21(DE3).Then the purified Sir protein was conducted the NAD+dependent deacetylation activity research.The obtained optimal pH was 9.0 and the optimal reaction temperature was 25 ℃.PZA had the inhibition effect to the Sir2 enzymatic activity under weakly acidic environment,but without the inhibiting effect under the basic pH environment.Conclusion The highly purified protein is obtained by using themolecular cloning technique,the optimal pH and optimal reaction temperature are also obtained,PZA has the inhibiting effect on it,which provides certain foundation for researching the antibacterial mechanism of ant-tuberculous drug PZA.

mycobacterial; deacetylase; gene clone; expression and purification; PZA

林雅寧，女，碩士，技師，主要研究免疫學(xué)和臨床檢驗(yàn)方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.021

A

1672-9455(2015)18-2703-02

2015-04-11

2015-05-15)