胡 敏，楊澤華，趙克斌(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，太原 030001)

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·論 著·

酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)乙型肝炎e抗原的空白限、檢出限及定量限的建立與評(píng)價(jià)*

胡 敏，楊澤華，趙克斌△(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，太原 030001)

目的 建立并評(píng)價(jià)酶聯(lián)免疫分析手工操作檢測(cè)HBeAg的空白限(LoB)、檢出限(LoD)及定量限(LoQ)。方法 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)EP-17A文件和有關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合工作實(shí)際，將HBeAg的空白樣品及系列低濃度樣品進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析手工操作的檢測(cè)，根據(jù)數(shù)據(jù)的分布規(guī)律，采用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，建立酶聯(lián)免疫分析手工操作檢測(cè)HBeAg的LoB、LoD及LoQ并進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 HBeAg的LoB為0.131 PEI U/mL，LoD為0.350 PEI U/mL，LoQ為0.450 PEI U/mL。結(jié)論 廠商聲明的LoB得到驗(yàn)證，同時(shí)建立了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HBeAg的LoB、LoD和LoQ，為臨床診斷和治療提供更有價(jià)值的信息。

乙型肝炎e抗原； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)； 空白限； 檢出限； 定量限

乙型肝炎e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒(HBV)C基因轉(zhuǎn)錄生成的循環(huán)蛋白，與乙型肝炎表面抗原一樣，是乙型肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)的直接指征，它的持續(xù)陽(yáng)性提示疾病慢性化，可能會(huì)進(jìn)展為慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化[1]。慢性乙肝患者接受干擾素或核苷酸類藥物治療時(shí)，血清HBeAg水平的高低直接反映患者的預(yù)后情況，因此HBeAg常用于評(píng)估乙肝抗病毒療效及傳染性強(qiáng)弱[2-3]。當(dāng)今國(guó)內(nèi)HBeAg檢測(cè)方法和儀器種類繁多，如何確保檢測(cè)系統(tǒng)間結(jié)果的可靠性成為當(dāng)務(wù)之急[4]。本研究主要參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)發(fā)布的《確定檢出限值和定量限值方案》，對(duì)酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)HBeAg的空白限(LoB)、檢出限(LoD)和定量限(LoQ)進(jìn)行建立和評(píng)價(jià)，旨在為臨床提供更可靠的診斷信息[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 酶聯(lián)免疫分析手工操作，試劑(批號(hào)201406101)由上?？迫A生物工程股份有限公司提供；美國(guó)PerkinElmer Wallac 1235全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀，試劑(批號(hào)8600021769)由蘇州新波生物技術(shù)有限公司提供；美國(guó)雷勃Wellscan MK3酶標(biāo)儀。

1.2 樣品制備 收集PE公司1235全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀檢測(cè)HBeAg水平為0 PEI U/mL的健康人新鮮血清50例混勻作為空白樣品，并檢測(cè)證實(shí)此混合血清HBeAg水平為0 PEI U/mL；用空白樣品對(duì)原始HBeAg樣品作系列稀釋，配置成系列低濃度HBeAg樣品，其理論水平分別為0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 PEI U/mL，介于LoB水平的1～4倍。所有樣品均無(wú)溶血、無(wú)黃疸、無(wú)脂濁，分裝于EP管中置-20 ℃冰箱保存。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)基本要求 試驗(yàn)前嚴(yán)格按照廠商操作規(guī)程對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)、校準(zhǔn)和質(zhì)量控制，確認(rèn)質(zhì)量控制結(jié)果在控的前提下方可檢測(cè)樣品。

1.3.2 LoB的確定[6]對(duì)空白樣品進(jìn)行60次測(cè)定，每日1批，每批重復(fù)檢測(cè)12次，共5 d，記錄吸光度值A(chǔ)。按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織，設(shè)定Ⅰ類錯(cuò)誤與Ⅱ類錯(cuò)誤水平均為5%，即α=β=5%，5%的α值相當(dāng)于使用空白值分布的95%百分位數(shù)，作為顯著高于空白的檢測(cè)值的限值。若空白值呈正態(tài)分布，按以下公式計(jì)算LoB：LoB=μB+1.645σB，其中μB和σB分別是空白檢測(cè)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。若空白值呈非正態(tài)分布，則用非參數(shù)方法估計(jì)第95%百分位數(shù)。將檢測(cè)值依據(jù)大小排列，求相應(yīng)的百分位數(shù)ρ=(100-α)=95，LoB=[nB(95/100)+0.5]位置的結(jié)果，式中nB為空白樣品的重復(fù)檢測(cè)次數(shù)，即nB=60。

1.3.4 LoQ的確定[6]依據(jù)臨床要求和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的允許誤差，設(shè)定本實(shí)驗(yàn)室HBeAg的總誤差目標(biāo)為20%，在不考慮分析偏差的條件下，總誤差=2CV，若低濃度樣本的CV≤1/2TEa，則LoQ=LoD；若TEa大于實(shí)驗(yàn)室制訂的質(zhì)量目標(biāo)20%，則需要選擇更高濃度的定值樣品重復(fù)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 濃度為0、0.970、2.260、6.590、7.490、14.980 PEI U/mL的各樣品其吸光度值分別為：0.005、0.169、0.643、1.512、1.899、2.552。將以上數(shù)據(jù)通過(guò)CurveExpert1.4進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果顯示二次多項(xiàng)式擬合法的擬合程度最高，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

2.2 LoB的建立 空白樣品的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，呈非正態(tài)分布，因此用非參數(shù)方法估計(jì)LoB，即估計(jì)第95%百分位數(shù)，將60個(gè)空白值由小到大排序后第51～60位數(shù)值見(jiàn)表1，LoB在[60×(95/100)+0.5]=57.5位置的值，即LoB=(57號(hào)結(jié)果+58號(hào)結(jié)果)/2，第57.5位結(jié)果為(0.131+0.131)/2=0.131 PEI U/mL，即LoB為0.131 PEI U/mL。

圖1 HBeAg濃度-吸光度曲線

秩號(hào)空白值秩號(hào)空白值510．128560．128520．128570．131530．128580．131540．128590．131550．128600．138

2.3 LoD的建立 系列低濃度樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。60個(gè)低濃度樣品檢測(cè)結(jié)果呈非正態(tài)分布，使用非參數(shù)程序估計(jì)LoD，即LoD = LoB+Ds、β，其中Ds、β是低濃度樣品測(cè)定值中位數(shù)的值和第5個(gè)百分位數(shù)值的間距。運(yùn)用SPSS19.0計(jì)算，中位數(shù)為0.392 PEI U/mL，第5百分位數(shù)的值為0.173 PEI U/mL，Ds、β=0.392-0.173=0.219 PEI U/mL。LoD=LoB+Ds、β=0.131+0.219=0.350 PEI U/mL。

表2 系列低濃度樣品測(cè)定結(jié)果

注：xi1和xi2為同一天內(nèi)的2批測(cè)定結(jié)果。

表3 酶聯(lián)免疫分析手工操作檢測(cè)HBeAg低濃度樣品的日間CV

2.4 LoQ的建立 本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)臨床需求及權(quán)威機(jī)構(gòu)規(guī)定的分析質(zhì)量要求設(shè)定酶聯(lián)免疫分析手工操作檢測(cè)HBeAg的總誤差目標(biāo)為20%，在不考慮分析偏差的情況下，TEa=2CV，即CV=1/2TEa。HBeAg濃度在0.450 PEI U/mL時(shí)檢測(cè)的日間變異為8.95%，接近10.00%，符合質(zhì)量目標(biāo)要求，因此LoQ=0.450 PEI U/mL。見(jiàn)表3。

3 討 論

HBeAg/HBeAb血清學(xué)轉(zhuǎn)換是HBV復(fù)制下降的可靠標(biāo)志，HBeAg陽(yáng)性與否使慢性乙肝患者的臨床經(jīng)過(guò)和治療應(yīng)答效果有很大差別。但是任何定量試驗(yàn)均存在可接受的偏差，定性試驗(yàn)也必然存在一定的漏檢率[7]。為了防止弱陽(yáng)性標(biāo)本的漏檢，有效地提高檢出率，各臨床實(shí)驗(yàn)室可以科學(xué)地建立滿足各實(shí)驗(yàn)室自己質(zhì)量要求的檢測(cè)限，將更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果反饋給臨床[8]。

LoB、LoD和LoQ是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法或檢測(cè)系統(tǒng)靈敏性的重要參數(shù)，因此LoD與LoQ的設(shè)定是至關(guān)重要的，因?yàn)榇_定極微量的待測(cè)物質(zhì)對(duì)于疾病的確定，尤其是傳染性疾病的確診具有很大意義[9]。EP17-A文件就如何確定臨床檢驗(yàn)方法的檢測(cè)低限，如何基于實(shí)驗(yàn)室在低水平濃度處的性能目標(biāo)確定定量檢測(cè)限提出了建議。本研究嚴(yán)格按照EP17-A方案，建立了酶聯(lián)免疫分析手工操作檢測(cè)HBeAg的LoB為0.131 PEI U/mL，低于廠商說(shuō)明書(shū)聲明的靈敏度0.154 PEI U/mL，LoD為0.350 PEI U/mL，LoQ為0.450 PEI U/mL。使用酶聯(lián)免疫分析手工操作檢測(cè)HBeAg結(jié)果報(bào)告時(shí)，若HBeAg結(jié)果低于0.131 PEI U/mL，則報(bào)告“分析物未檢出，濃度低于0.131 PEI U/mL”；若HBeAg結(jié)果高于0.131 PEI U/mL，低于0.350 PEI U/mL，則報(bào)告“有分析物檢出，但不能準(zhǔn)確定量，濃度小于0.350 PEI U/mL”；若HBeAg結(jié)果高于0.450 PEI U/mL，則直接報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。

已有研究證實(shí)，全自動(dòng)酶免檢測(cè)設(shè)備在過(guò)程處理的速度、靈敏度和精密度方面均優(yōu)于手工操作，因其試驗(yàn)的全過(guò)程加樣、加試劑、孵育、洗板、結(jié)果判讀等均由電腦控制，消除了手工操作的人為誤差，使得加樣、加試劑準(zhǔn)確，孵育時(shí)間嚴(yán)格控制，檢測(cè)的靈敏度相應(yīng)提高[10]。本科室已引入Addcare ELISA 1100全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)及Beckman Coulter公司Power Express自動(dòng)化流水線，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀將成為酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)室的主導(dǎo)設(shè)備，酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)室的自動(dòng)化與標(biāo)準(zhǔn)化是實(shí)現(xiàn)全實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化的一部分。根據(jù)CNAS-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量與能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要求，設(shè)備在安裝時(shí)及常規(guī)使用中應(yīng)顯示出能夠達(dá)到規(guī)定的性能標(biāo)準(zhǔn)。以后作者將對(duì)Addcare ELISA 1100全自動(dòng)酶免儀的分析性能進(jìn)行系統(tǒng)、全面的評(píng)價(jià)[11]。

[1]Lang T,Lo C,Skinner N,et al.The hepatitis Be antigen(HBeAg)targets and suppresses activation of the toll-like receptor signaling pathway[J].Hepatol,2011,55(4):762-769.

[2]郝迎迎,夏娟,劉勇，等.血清HBeAg定量檢測(cè)對(duì)慢性乙型肝炎患者核苷(酸)類似物治療后e抗原血清轉(zhuǎn)化的預(yù)測(cè)作用[J/CD].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版,2012,6(11):2915-2920.

[3]萬(wàn)謨彬,翁心華.干擾素治療慢性乙型肝炎專家建議[J].中華傳染病雜志,2010,28(4):193-200.

[4]蘇榮，葉桂樣，羅娜，等.乙型肝炎病毒E抗原檢測(cè)方法性能的初步評(píng)價(jià)[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,2(31):21-23.

[5]NCCLS.EP-17A Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation;Approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,2004:1-39.

[6]馮仁豐.臨床檢驗(yàn)質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2003：135-136.

[7]張瑞,李金明.如何發(fā)揮檢驗(yàn)醫(yī)師在HBV、HCV檢測(cè)結(jié)果臨床應(yīng)用中的作用[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2012,30(11):865-867.

[8]Andersson M,Ronnmark J,Arestrom I,et al.Inclusion of a non-immunoglobulin binding protein in two-site ELISA for quantification of human serum proteins without interference by heterophilic serum antibodies[J].Immunol Methods,2003,283(1/2):225-234.

[9]Iamail AA.A radical approach is needed to eliminate interference from endogenous antibodies in immunoassays[J].Clin Chem,2005,51(1):25-26.

[10]李玉笑,鄭優(yōu)榮,肖韶英,等.FAME酶標(biāo)分析系統(tǒng)在安全輸血中的應(yīng)用[J].廣東醫(yī)學(xué),2002,23(5):461-463.

[11]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS-CL02 2012醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則[S].北京：中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2012.

Establishment and evaluation of limit of blank,limit of detection and limit of quantitation for detection of HBeAg by enzyme-linked immunosorbent assay*

HUMin,YANGZe-hua,ZHAOKe-bin△

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan,Shanxi030001,China)

Objective To establish the limit of blank(LoB),limit of detection(LoD) and limit of quantitation(LoQ) for the detection of HBeAg by the enzyme-linked immunosorbent assay.Methods Referring to CLSI EP-17A protocol and related literature,and by combining with our actual works,the blank sample and a series of low concentration samples were performed the ELISA detection by the manual operation.According to the distribution law of the data,the corresponding statistical method was adopted to establish the ELISA detection of LoB,LoD and LoQ of HBeAg by the manual operation.Results LoB of HBeAg measured by the manual operation was 0.131 PEI U/mL,LoD was 0.350 PEI U/mL and LoQ was 0.450 PEI U/mL.Conclusion The LoB of HBeAg stated by the manufacturer is verified.At the same time,LoB,LoD and LoQ of HBeAg detected by our laboratory are established,which provide more valuable information for the clinical diagnosis and therapy.

HBeAg; enzyme-linked immunosorbent assay; limit of blank; limit of detection; limit of quantitation

衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心資助項(xiàng)目(28-1-45)。

胡敏，女，碩士，初級(jí)檢驗(yàn)師，主要從事檢驗(yàn)方法學(xué)方面的研究。△

，E-mail：syyyjykzkb@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.004

A

1672-9455(2015)18-2656-03

2015-04-10

2015-05-10)