張斯?jié)h，李榮亨，巫艷芬，潘富林，蔡威黔，陳 鏗，羅光平，李萍華，黃 耿，陳薇薇，羅 寧*

·藥學(xué)研究·

HPLC法測(cè)定復(fù)元膠囊三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量

張斯?jié)h1，李榮亨2，巫艷芬3，潘富林1，蔡威黔1，陳 鏗1，羅光平1，李萍華1，黃 耿1，陳薇薇1，羅 寧1*

目的 采用HPLC法檢測(cè)復(fù)元膠囊中主要成分三七皂苷R1和淫羊藿苷的含量。方法 取3個(gè)不同批次復(fù)元膠囊各5粒，經(jīng)溶解、醇提、萃取、過(guò)濾等處理后采用HPLC檢測(cè)其含量，以地高辛為內(nèi)標(biāo)，獲得藥品和內(nèi)標(biāo)曲線下面積之比，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量。結(jié)果 計(jì)算出每粒復(fù)元膠囊中三七皂苷R1的含量為12.18 mg/g，淫羊藿苷的含量為54.65 mg/g。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)HPLC方法可行，能準(zhǔn)確檢測(cè)復(fù)元膠囊中三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量。

復(fù)元膠囊；三七皂苷R1；淫羊藿苷；含量測(cè)定；HPLC

0 引言

復(fù)元膠囊是重慶醫(yī)科大學(xué)李榮亨教授課題組研制的院內(nèi)制劑，藥效學(xué)、毒理學(xué)[1]及作用機(jī)制方面的文獻(xiàn)證實(shí)該藥能有效治療骨關(guān)節(jié)炎，并對(duì)以氣虛血瘀、肝腎不足為主要癥候表現(xiàn)的老年病有確切療效。

復(fù)元膠囊以淫羊藿補(bǔ)腎陽(yáng)、祛風(fēng)濕，三七活血行淤為君，人參、黃芪補(bǔ)氣益精為臣。根據(jù)張文亮等[2]的研究，復(fù)元膠囊主要成分三七皂苷和淫羊藿苷均可顯著降低uPA、NF-κB(P65)的mRNA表達(dá)量，保護(hù)軟骨細(xì)胞免受炎癥因子的損傷。鑒于復(fù)元膠囊的主要成分三七皂苷R1及淫羊藿苷是復(fù)元膠囊中治療的有效成分，將其作為復(fù)元膠囊的質(zhì)控指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)復(fù)元膠囊中2種成分的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 試藥與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 復(fù)元膠囊，配方由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院李榮亨教授提供，所有藥材均購(gòu)于重慶桐君閣藥材批發(fā)公司，由重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn)為膠囊,批號(hào)：A20130816、B20130922、C20131017。每粒膠囊重0．41 g，每克粉末相當(dāng)于生藥3 g。對(duì)照品：三七皂苷R1及淫羊藿苷(純度>98%)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。內(nèi)標(biāo)：地高辛，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈、正丁醇、石油醚均為分析純，由北京瑞福偉達(dá)化工有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材 高效液相色譜：安捷倫1200高效液相色譜儀,安捷倫公司。湘儀TG16-W微量臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)有限公司。XB220A電子天平，上海精科天平儀器廠。KPD-1004臺(tái)式超聲乳化儀，深圳市科普達(dá)機(jī)電設(shè)備公司。XW80快速混合儀，上海滬西分析儀器有限公司。

1.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液 精確稱取三七皂苷R1及淫羊藿苷，用甲醇分別制成濃度為0.2 mg/mL和0.8 mg/mL的儲(chǔ)備液，備用。

1.4 供試品儲(chǔ)備液 隨機(jī)取5粒復(fù)元膠囊，取內(nèi)容物，混勻，精密稱取0.2 g粉末，置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液，超聲處理1 h，過(guò)濾，濾液加入石油醚萃取2次，再加入正丁醇萃取2次，揮干，加入甲醇5 mL，溶解，過(guò)濾，濾液超聲處理1 h，通過(guò)0.45 μm微孔濾膜后40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑? ℃保存，檢測(cè)時(shí)用甲醇復(fù)溶1 mL備用。

2 實(shí)驗(yàn)與方法

2.1 色譜條件 色譜柱:島津GL/SHIMADUZ-GL色譜柱(4.6 μm×250 μm)；梯度洗脫法，流動(dòng)相包含乙腈-水，0～10 min：20%(乙腈含量百分比)，11～17 min：20%～46%，18～35 min：46%～55%；柱溫28 ℃，流速1.0 mL/min；內(nèi)標(biāo)：200 μg/mL地高辛溶液。進(jìn)樣量100 μL,測(cè)定波長(zhǎng)203 nm。

2.2 線性關(guān)系考察 精確量取儲(chǔ)備液10、20、50、200、400 μL，加甲醇至1 mL，并加內(nèi)標(biāo)地高辛10 μg/mL?？焖倩靹颍看稳?0 μL進(jìn)樣，以三七皂苷R1及淫羊藿苷和內(nèi)標(biāo)的曲線下面積比為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，模擬兩條曲線方程：三七皂苷R1的線性回歸方程為Y=0.088 75 X-0.017 5，淫羊藿苷的線性回歸方程為Y=0.104 4 X+0.345。R=0.999 8，說(shuō)明淫羊藿苷在8～320 μg/mL、三七皂苷R1在2～80 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度 分別量取10、50、100 μL 3個(gè)濃度的三七皂苷R1和淫羊藿苷，日內(nèi)每個(gè)濃度進(jìn)5針，計(jì)算RSD，三七皂苷R1為1.28%，淫羊藿苷為1.06%；連續(xù)5 d每天進(jìn)針1次，共5針，計(jì)算日間RSD，三七皂苷R1為1.35%，淫羊藿苷為1.17%。

2.4 穩(wěn)定性和重復(fù)性 分別量取10、50、100 μL 3個(gè)濃度的三七皂苷R1和淫羊藿苷，室溫(20 ℃)及凍融(-4 ℃)條件下檢測(cè)藥物峰和內(nèi)標(biāo)峰面積之比，計(jì)算RSD。室溫下三七皂苷R1 的RSD分別為1.27%、1.43%、1.31%，淫羊藿苷的RSD分別為1.71%、1.45%、1.62%。

2.5 回收率試驗(yàn) 在已知濃度的三七皂苷R1和淫羊藿苷供試品溶液中，分別加入80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，每個(gè)濃度5份，HPLC檢測(cè)三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量，取5次檢測(cè)平均值計(jì)算加樣回收率(測(cè)得濃度-樣品濃度)/加入濃度×100%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三七皂苷R1及淫羊藿苷加樣回收率(μg，n=5)

2.6 三七皂苷R1及淫羊藿苷色譜圖 見(jiàn)圖1。

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果 取A、B、C 3個(gè)批次的復(fù)元膠囊，每個(gè)批次隨機(jī)取5粒檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 復(fù)元膠囊中三七皂苷R1和淫羊藿苷含量(mg/g)(n=5)

3 討論

中藥三七含有三七總皂苷，由三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1組成。其中，三七皂苷R1和淫羊藿苷被證實(shí)在復(fù)元膠囊的治療效應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[2-3]。藥典記載，三七皂苷R1在203 nm處有最大紫外吸收光譜，能被HPLC的紫外檢測(cè)器所檢測(cè)[4]。同時(shí)，人參皂苷Rg1、Rb1在此處也有最大吸收峰，但是根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后兩者出峰時(shí)間在25 min以后，基本上不會(huì)對(duì)三七皂苷R1的峰形造成干擾。淫羊藿苷最大紫外吸收峰在270 nm處，但是在203 nm處也有吸收?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定內(nèi)標(biāo)地高辛的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm[5]，根據(jù)作者的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其在203 nm處也有吸收。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，能同時(shí)檢測(cè)三七皂苷R1和淫羊藿苷的含量。采用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)藥物含量，能避免由于色譜方法學(xué)以及樣品前處理過(guò)程中造成的誤差，是一種相對(duì)精確的方法。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)中，三七皂苷R1、淫羊藿苷及內(nèi)標(biāo)分別在不同的時(shí)間出峰，相互之間無(wú)干擾，峰形好，無(wú)拖尾，是同時(shí)檢測(cè)復(fù)元膠囊主要成分三七皂苷R1及淫羊藿苷的科學(xué)、可靠的方法。

圖1 色譜行為

[1] 劉嬋娟,李榮亨,楊俊卿.復(fù)元膠囊的毒理學(xué)研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,34(7):916-919.

[2] 張文亮,李榮亨,王淑美,等.復(fù)元膠囊對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨uPA、uPAR、PAI及NF-κB表達(dá)的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(20):2172-2176.

[3] 張文亮,李榮亨,王淑美,等.復(fù)元膠囊及其主要成分淫羊藿苷、三七皂苷R1治療骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制研究[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(15):2113-2117.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:10-11.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:181-182.

Determination of notoginsenoside R1 and icariin in Fuyuan capsule by HPLC

ZHANG Si-han1，LI Rong-heng2，WU Yan-fen3，PAN Fu-lin1，CAI Wei-qian1，CHEN Keng1，LUO Guang-ping1，LI Ping-hua1，HUANG Geng1，CHEN Wei-wei1，LUO Ning1*

(1.Shenzhen Longgang District People′s Hospital,Shenzhen 518172,China;2.The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;3.Shenzhen Longgang Hospital of TCM,Shenzhen 518172,China)

Objective To establish an HPLC method for the determination of notoginsenoside R1 and icariin in Fuyuan capsule.Methods 5 capsules from different batches of target medicine were detected by HPLC after dissolution,ethanol extraction,normal butanol extraction and filtration.Digoxin was as a interior label and the ratio of AUC targets/AUC digoxin were gotten.The contents were calculated by standard curve.Results The content of notoginsenoside R1 and icariin were 12.18 mg/g and 54.65 mg/g respectively.Conclusion The HPLC method in the study is feasible and the experiment data of contents are precise.

Fuyuan capsule;Notoginsenoside R1;Icariin;Content determination;HPLC

2014-08-15

1.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，深圳 518172；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400016；3.深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院，深圳 518172

深圳市龍崗區(qū)科技局基金課題(YS2012125)

10.14053/j.cnki.ppcr.201503016

*通信作者