彭 揚，霍翠翠，閆 芳，呂 靜，白 雪，李 慧

辛伐他汀對新診斷2型糖尿病患者單核巨噬細(xì)胞膽固醇外流的影響

彭 揚*，霍翠翠，閆 芳，呂 靜，白 雪，李 慧

目的 研究新診斷2型糖尿病患者外周血單核巨噬細(xì)胞SR-B1、ABCA1表達(dá)及膽固醇外流的變化，以及辛伐他汀治療對上述指標(biāo)的影響。方法 采用Western 印跡法及RT-PCR方法檢測新診斷糖尿病患者(A1、B1組)、正常對照組(C組)及辛伐他汀治療后(A2、B2組)外周血單核巨噬細(xì)胞SR-B1、ABCA1蛋白及mRNA表達(dá)、膽固醇外流率。結(jié)果 新診斷糖尿病患者單核巨噬細(xì)胞SR-B1 蛋白及mRNA表達(dá)各組間以及治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ABCA1 蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，辛伐他汀治療后B2組升高明顯(P<0.05)，但仍顯著低于C組(P<0.05)。兩個糖尿病組膽固醇外流率明顯下降(P<0.05)，A1、B1兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后的A2組膽固醇外流率輕度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，B2組膽固醇外流率顯著升高(P<0.05)，但未達(dá)到C組水平(P<0.05)。巨噬細(xì)胞膽固醇外流率與ABCA1蛋白及mRNA表達(dá)密切相關(guān)(r1=0.752，r2=0.724，P<0.05)。結(jié)論 新診斷2型糖尿病患者的外周血單核巨噬細(xì)胞膽固醇外流率較正常對照組明顯下降，這種變化可能與轉(zhuǎn)運體ABCA1表達(dá)下降有關(guān)。辛伐他汀治療可能通過部分提高ABCA1表達(dá)從而增加膽固醇外流而起到抗動脈粥樣硬化作用。

膽固醇外流；SR-B1；ABCA1；辛伐他汀

0 引言

動脈粥樣硬化性心血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)包括冠心病、動脈粥樣硬化性卒中和外周血管疾病，是目前發(fā)病率及死亡率非常高的疾病[1]。高血糖人群ASCVD發(fā)病率明顯升高，2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)患者危險性升高2～4倍，即使在血糖輕度升高的葡萄糖耐量異常人群也是如此[2]。高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)通過轉(zhuǎn)運動脈巨噬細(xì)胞多余的膽固醇從細(xì)胞內(nèi)流出-膽固醇逆轉(zhuǎn)運來預(yù)防ASCVD[3]。其中B類1型清道夫受體(Scavenger receptor class B，type 1,SR-B1)是HDL的受體，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)是該過程中的膽固醇轉(zhuǎn)運體，二者均在介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運中起重要作用[4]。本研究旨在通過新診斷T2DM患者外周血單核巨噬細(xì)胞SR-B1及ABCA1表達(dá)、膽固醇外流的變化以及辛伐他汀治療對上述指標(biāo)的影響，從而進(jìn)一步探討糖尿病患者動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生機制及他汀類藥物在糖尿病動脈粥樣硬化中的作用。

1 方法

1.1 研究對象 按1999 年WHO 糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),收集2012年3-12月在我院體檢新診斷的2 型糖尿病患者。將其隨機分為常規(guī)治療組(A1組)和辛伐他汀治療組(B1組)，體檢健康非糖尿病組(C組)。排除標(biāo)準(zhǔn)包括拒絕參加者，不能隨訪者，血液動力學(xué)改變者，高血壓，糖尿病微血管并發(fā)癥，血清三酰甘油(TG)≥5 mmol/L，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)≥3.37 mmol/L，嚴(yán)重的肝腎疾病、肺部疾病、腫瘤、自身免疫性疾病及各種感染性疾病。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。

1.2 方法 對所有受試者詢問病史，年齡，測量血壓及身高、體重、腰圍等人體參數(shù)。受試對象正常飲食3 d，空腹12 h后采集外周靜脈血40 mL,常規(guī)方法測定空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、TG、LDL-C及HDL-C；其余35 mL抗凝血用于分離外周血單個核細(xì)胞，進(jìn)行下一步試驗。所有入選人員均同樣接受飲食指導(dǎo)，運動指導(dǎo)；A1、B1組在此基礎(chǔ)上根據(jù)治療指南選擇合適的口服降糖藥物并逐漸調(diào)整劑量，B1組受試者額外每日睡前口服辛伐他汀40 mg，每月監(jiān)測一次肝功能(肝功能異常者停止試驗)，24周后重新采血測定上述各項指標(biāo)，具體分組方案見圖1。

圖1 研究方案分組圖解

1.2.1 材料 辛伐他汀為杭州默沙東制藥公司產(chǎn)品；人淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋)；兔抗人SR-BI多克隆抗體(美國Novus)；兔抗人ABCA1多克隆抗體 (武漢博士德公司)；油紅 O、[3H]膽固醇 (Sigma公司 )，PCR引物(北京奧科)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 人外周血單核細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取受試者外周靜脈血，應(yīng)用PBS 1∶1稀釋后，細(xì)胞懸液加在與血液等量的淋巴細(xì)胞分離液(d=1.077)上，1 500 r/min離心20 min。收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個核細(xì)胞，洗滌2次。用含10 %胎牛血清(Fetal calf serum，F(xiàn)CS) 的 1 640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后均勻接種于培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)基，用37 ℃預(yù)熱的培養(yǎng)基清洗3遍，將未貼壁細(xì)胞洗脫。剩下的單核細(xì)胞予以10%自身血清+10 ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)+RPMI 1 640培養(yǎng)72 h使細(xì)胞巨噬化，油紅O染色及CD68免疫組化染色鑒定巨噬細(xì)胞。

1.2.3 Western 印跡法 將培養(yǎng)后的細(xì)胞用PBS洗2次，加入細(xì)胞膜裂解液，冰浴超聲粉碎細(xì)胞，離心15 min(4 ℃,12 000×g)，取上清液測定細(xì)胞溶解物中蛋白含量，取相同量蛋白(50 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉PBS-T液室溫封閉1 h，加入一抗：SR-B1抗體(1∶800)；ABCA1抗體(1∶150稀釋)4 ℃孕育過夜，將膜洗滌3次后再置于1∶500稀釋的山羊抗兔二抗中室溫作用2h，相同方式洗滌后用ECL方法顯色，X-片感光，洗片。蛋白條帶經(jīng)掃描后進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4 RT-PCR檢測 根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計引物，人SR-BI上游引物：5′ -TGA CCG GGT GGA TGT CCA GGA AC -3′,下游引物：5′ -TGA TGATGG AGA ATA AGC CCA T -3′,擴增片段 696 bp；ABCA1上游引物：5′- ACA ACC AAA CCT CAC ACTACT G-3′,下游引物：5′ - ATA GAT CCC ATT ACA GAC AAC G-3′,擴增片段439 bp；GAPDH上游引物：5′ -TGA ACG GGA AGC TCG CTG G-3′,下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′,擴增片段307 bp。用Trizol提取細(xì)胞總RNA后，用RT-PCR檢測mRNA表達(dá)，PCR總反應(yīng)體系25 μL。SR-BI PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，在95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min條件下循環(huán)35次；ABCA1 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，在94 ℃ 1 min，61 ℃30 s，72 ℃ 1 min條件下循環(huán)38次；GAPDH PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，在94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min條件下循環(huán)30次，最后72 ℃終止5 min。PCR產(chǎn)物以1.5 %瓊脂糖凝膠電泳觀察、掃描，以同管GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行比值半定量分析。

1.2.5 膽固醇外流率檢測 單核細(xì)胞培養(yǎng)72 h,待細(xì)胞巨噬化后,將細(xì)胞接種于 24 孔板，每孔 2.0×104個細(xì)胞，每組設(shè)2個復(fù)孔。加入3.7×104Bq/mL的[3H]膽固醇孵育液,37 ℃孵育24 h后棄去并清洗細(xì)胞。以5 %自身血清誘導(dǎo)膽固醇外流,誘導(dǎo)完成后收集液體，離心取上清為細(xì)胞外流液。細(xì)胞清洗后加入 0.5% Triton-X100，振蕩 1 h 后收集細(xì)胞裂解液。分別將兩種液體與閃爍液混合，充分混勻后液閃計數(shù)。分別測量上清液及細(xì)胞裂解液中[3H]含量，并計算外流率:膽固醇外流率 = 細(xì)胞外流液[3H]/ ( 細(xì)胞外流液[3H]+細(xì)胞裂解液[3H])×100%。

2 結(jié)果

2.1 受試者的基線臨床特點及用藥前后變化 完成受試者共34名，其基本資料及臨床指標(biāo)見表1、表2。

表1 受試者的基本資料

表2 各組臨床指標(biāo)比較(mmol/L)

注：*與C組比較，P<0.05；▲與治療前(A1/B1)比較，P<0.05；#與A2組比較,P<0.05

由表1、表2可見，A、B、C組在入組時比較，除FBG、HbA1c及TG外，其余各項指標(biāo)(包括LDL-C)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，即三組基本資料具有可比性。治療結(jié)束時糖尿病組FBG、HbA1c、TG均明顯下降(P<0.05)；其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；辛伐他汀治療后的B2組除上述指標(biāo)變化外，TC及LDL-C也下降(P<0.05)，LDL-C低于C組(P<0.05)。

2.2 SR-B1和ABCA1的蛋白及mRNA表達(dá) Western 印跡法分析SR-B1及ABCA1蛋白表達(dá)見圖2和圖3。SR-B1蛋白無論在治療前還是治療后，組間及組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而ABCA1蛋白表達(dá)在A1組和B1組較C組明顯下降(P<0.05)，A1、B1兩組間ABCA1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。B2組ABCA1蛋白表達(dá)較B1組升高，但仍明顯低于C組(P<0.05)。

SR-B1和ABCA1 mRNA與蛋白變化趨勢一致，即SR-B1 mRNA無論組間還是治療前后均無明顯變化，而ABCA1 mRNA在初期A1、B1組較C組明顯下降(P<0.05)，治療后的B2組升高明顯(P<0.05)，但仍低于C組(P<0.05)，見表3。

表3 各組SR-B1和ABCA1mRNA相對表達(dá)量

注：*與C組比較，P<0.05；▲與B1組比較，P<0.05；#與A2組比較，P<0.05

圖2 Western 印跡法分析SR-B1及ABCA1蛋白表達(dá)

圖3 各組SR-B1及ABCA1蛋白表達(dá)對比

2.3 膽固醇外流率的變化及與SR-B1和ABCA1的相關(guān)性分析 治療前三組間比較，巨噬細(xì)胞膽固醇外流率在A1組和B1組明顯下降(P<0.05)，A1、B1兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。組內(nèi)前后比較，A2組膽固醇外流率較A1組輕度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，B2組膽固醇外流率較B1組顯著升高(P<0.05)，但仍明顯低于C組(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組巨噬細(xì)胞膽固醇外流率比較

相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，受試者巨噬細(xì)胞膽固醇外流率與ABCA1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r1=0.752和r2=0.724(P<0.05)。與SR-B1的蛋白及mRNA表達(dá)水平之間未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

AS病變早期的細(xì)胞病理學(xué)改變是單核巨噬細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞[5]，而膽固醇由巨噬泡沫細(xì)胞血管壁流出是膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程的首要步驟，有利于維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)，在預(yù)防脂質(zhì)在血管壁的沉積及AS的進(jìn)展發(fā)揮了極其重要的作用[6]。

糖尿病以高血糖為主要特征，但即使嚴(yán)格控制血糖至正常水平，糖尿病ASCVD發(fā)生率及死亡率仍然未下降[7]。這說明血糖水平并非是影響糖尿病ASCVD的主要原因。多項研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者經(jīng)常伴隨HDL-C降低，而且HDL-C的數(shù)量也不能完全反映其功能，外周細(xì)胞膽固醇外流率是直接反映HDL功能的重要指標(biāo)之一[3]。HDL的受體SR-B1及轉(zhuǎn)運體ABCA1均被證實可以介導(dǎo)膽固醇外流。本研究以新診斷的T2DM患者為研究對象，以外周血單核巨噬細(xì)胞SR-B1與ABCA1表達(dá)及膽固醇外流變化來說明T2DM對AS的影響。研究發(fā)現(xiàn)，新診斷糖尿病患者外周血單核巨噬細(xì)胞SR-B1表達(dá)與非糖尿病者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而ABCA1表達(dá)明顯下降，無論從蛋白水平還是mRNA水平均得出相似的結(jié)論，這與多項研究結(jié)果相一致[2,8-9]。但也有研究未發(fā)現(xiàn)糖尿病患者ABCA1表達(dá)的變化[10]，分析原因考慮可能與研究對象的基礎(chǔ)狀態(tài)不同有關(guān)。從膽固醇外流率變化來看，糖尿病患者較非糖尿病者巨噬細(xì)胞膽固醇外流率明顯下降，且與ABCA1表達(dá)密切相關(guān)。從該結(jié)果分析新診斷糖尿病患者外周血單核巨噬細(xì)胞膽固醇外流率下降可能是致AS的原因之一，而且這一過程可能是通過轉(zhuǎn)運體ABCA1表達(dá)下降而不是SR-B1變化實現(xiàn)的。

他汀類藥物可以通過多種機制發(fā)揮抗AS作用[11-12]，在糖尿病ASCVD預(yù)防及治療方面他汀類藥物起到了重要的作用[13-14]。本研究通過對新診斷糖尿病患者應(yīng)用辛伐他汀治療前后檢測上述指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，患者外周血單核細(xì)胞SR-B1蛋白及mRNA表達(dá)無明顯改變，而ABCA1蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高，同時患者外周血單核巨噬細(xì)胞膽固醇外流率明顯升高。而在非他汀治療的A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這說明辛伐他汀可以部分上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白及mRNA，并改善其膽固醇外流率。然而，從B2組治療后膽固醇外流率仍低于C組可以看出，辛伐他汀治療尚不能完全逆轉(zhuǎn)糖尿病患者巨噬細(xì)胞膽固醇外流率，即使LDL-C明顯下降，甚至低于正常對照組。這也說明單純應(yīng)用該類藥物，只能部分逆轉(zhuǎn)但不能完全阻止AS的發(fā)生發(fā)展。

他汀類藥物可以逆轉(zhuǎn)AS作用近期已經(jīng)形成專家共識[15]，但對于糖尿病患者應(yīng)用該類藥物仍然要考慮到其安全性問題，近年也有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可能影響葡萄糖代謝[16]，另外，目前通過評估發(fā)現(xiàn)，他汀治療導(dǎo)致新發(fā)糖尿病風(fēng)險增加9%[17]，因此在應(yīng)用他汀類藥物時，更需要遵循個體化的原則，以保證患者用藥安全?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)，新診斷T2DM患者外周血單核巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)，及膽固醇外流率明顯下降，這可能是糖尿病致AS的原因之一。辛伐他汀治療后二者均顯著升高，且密切相關(guān)，說明辛伐他汀治療可能通過部分提高ABCA1表達(dá)，從而增加膽固醇外流而起到抗AS作用。

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Effect of simvastatin on cholesterol efflux from macrophages of patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus

PENG Yang*,HUO Cui-cui，YAN Fang，Lü Jing，BAI Xue,LI Hui

(Department of Geriatrics，Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004，China)

Objective To learn the effects of diabetes status and simvastatin on cholesterol efflux from human peripheral blood monocytes(PBMC)-derived macrophages,as well as the expression of scavenger receptor B1(SR-B1)and ATP-binding cassette receptor A1(ABCA1).Methods Blood was collected from subjects with newly diagnosed type 2 diabetes(T2DM: Group A1 and B1)and controls(Group C).Peripheral blood monocytes were differentiated for 72 h into macrophages.The expression of SR-B1 and ABCA1 protein and mRNA were detected by Western blot and RT-PCR,respectively.Cholesterol efflux assays were performed at the same time.The experiments were repeated after twenty-four weeks simvastatin treatment(Group A2-A1 without simvastatin; Group B2-B1 with simvastatin).Results The expression of SR-B1 mRNA and protein was not significantly different among three groups,as well as that of simvastatin treatment(P>0.05).In contrast,the expression of ABCA1 in macrophages from patients with T2DM significantly reduced(P<0.05).After twenty-four weeks simvastatin treatment,it was still lower than that of controls(P<0.05),although it was upreglulated significantly(P<0.05).In addition,cellular cholesterol efflux from macrophages to autologous serum significantly reduced in group A1 and B1,compared with group C(P<0.05).In group A2,there was a slightly increase in macrophages cholesterol efflux,which was not significantly different compared with that in group A1(P<0.05).Nevertheless,cholesterol efflux in group B2 ascended significantly compared with that in group B1(P<0.05).The change of macrophage cholesterol efflux correlated with the expression of ABCA1 significantly(r1=0.752，r2=0.724，P<0.05).Conclusion Cholesterol efflux reduced in macrophages of new diagnosis T2DM,which may be correlated with down regulating of ABCA1.Simvastatin may plays a protective role through improving cholesterol efflux and upregulating ABCA1 expression.

Cholesterol efflux; SR-B1; ABCA1; Simvastatin

2014-11-01

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科，沈陽 110004

遼寧省科技計劃項目(2011225020)

10.14053/j.cnki.ppcr.201503004

*通信作者