張海燕，孫 紅

Rapamycin增強上皮性卵巢癌細胞株對順鉑的敏感性研究

張海燕，孫 紅*

目的 比較單獨mTOR抑制劑Rapamycin、單獨順鉑或聯(lián)合2種制劑對上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2細胞增殖和凋亡的影響。方法 采用Western blot檢測Rapamycin對mTOR的抑制效應，檢測順鉑對mTOR信號通路的影響度。采用單獨Rapamycin、單獨順鉑或聯(lián)合2種制劑作用于上皮性卵巢癌SKOV3和ES-2細胞，運用MTT和FCM比較不同治療方案對其增殖和凋亡的影響。結果 在正常培養(yǎng)條件下，100 nmol/L Rapamycin作用24 h，上皮性卵巢癌細胞內(nèi)p-mTOR表達顯著抑制；順鉑可影響上皮性卵巢癌ES-2細胞mTOR信號通路的激活情況；與單獨順鉑作用和單獨Rapamycin作用比較，聯(lián)合兩種制劑顯著增加SKOV3和ES-2細胞的早期凋亡率，抑制細胞增殖(P均<0.05)。結論 mTOR信號通路在上皮性卵巢癌順鉑化療中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，Rapamycin可通過抑制mTOR激活而增強順鉑的殺傷作用。

上皮性卵巢癌；mTOR；Rapamycin；順鉑

0 引言

卵巢癌(Ovarian cancer，OC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，病死率位居婦科惡性腫瘤首位?；熢诼殉舶┲委熤姓紦?jù)著重要的地位。以鉑類為基礎的聯(lián)合治療為上皮性卵巢癌的一線化療方案，但鉑類藥物的毒副反應以及抗藥性問題越來越突出，成為治療的瓶頸。PI3K/AKT/mTOR信號通路在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展以及化療耐藥方面發(fā)揮著重要作用。本文擬采用順鉑作用于上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2細胞，觀察不同時間、不同濃度作用下，mTOR信號通路激活情況；比較單獨抑制劑(Rapamycin)、單獨順鉑以及聯(lián)合2種制劑的治療方案對SKOV3、ES-2細胞的增殖及凋亡的影響，觀察Rapamycin對順鉑抗腫瘤效應的影響，為篩選有效的化療方案提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞 人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3、ES-2細胞均購自ATCC。將SKOV3、ES-2細胞按照106/mL密度接種于100 mL的培養(yǎng)瓶中，用含10% FBS、1%鏈青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液，細胞生長至80%～90%，胰酶消化、傳代。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2 主要試劑 兔抗人磷酸化mTOR單克隆抗體、兔抗人mTOR抗體、兔、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、Rapamycin均購自美國Cell Signal公司。MTT、AnnexV-PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.3 Western blot檢測p-mTOR表達 收集施加不同處理因素的細胞5×106個，4 ℃ PBS洗滌2次，加入RIPA 100 μL，蛋白酶抑制劑1 μL，冰上裂解30 min，以12 000 r/min速度在4 ℃離心30 min；95 ℃變性5 min，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，270 mA半干濕轉膜90 min(Bio-Rad)；5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗(mTOR1∶1 000、p-mTOR 1∶800)4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次15 min；加入熒光二抗(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，每次15 min；Odessey檢測、拍照和分析。

1.4 MTT法檢測細胞抑制率 根據(jù)Western blot結果，配置藥物濃度；細胞接種96孔板，分4組：①陰性對照組，即加入無藥物的培養(yǎng)液；②陽性對照組，即加入含有DMSO不含藥物的培養(yǎng)基；③空白對照組，即無細胞只加不含藥物的培養(yǎng)液；④Rapamycin實驗組，即加入含有0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L不同濃度的Rapamycin的培養(yǎng)液。每個濃度設置3個平行孔；細胞培養(yǎng)48 h后，棄去上清，加入200 μL DMSO,充分溶解后，放置酶標儀OD450，讀出結果并分析。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 根據(jù)MTT和Western blot結果，選擇作用濃度。細胞接種6孔板，分3組：①單獨順鉑(20 μmol/L)組；②單獨抑制劑Rapamycin(0.1 μmol/L)組；③順鉑(20 μmol/L)聯(lián)合Rapamycin(0.1 μmol/L)組。加藥處理24 h后，常規(guī)消化收集細胞，Annexin V-PI雙染色，流式細胞儀分析。每種條件做3個平行孔，并重復3次。細胞培養(yǎng)48 h后，棄去上清，胰酶消化、PBS洗滌后，按照凋亡試劑盒步驟進行固定，染色，上機檢測。

2 結果

2.1 順鉑誘導上皮性卵巢癌ES-2細胞中AKT磷酸化 順鉑以20 μmol/L加入上皮性卵巢癌ES-2細胞上清液中(原上清液中含5%FBS)，結果顯示：作用5 min后，p-AKT表達明顯增加，30 min最顯著，隨后至120 min時略下降并持續(xù)在一定水平。見圖1-A。將不同濃度順鉑加入上皮性卵巢癌ES-2細胞上清液中(原上清液中含5% FBS)，結果顯示：暴露120 min后，20 μmol/L可顯著增加p-AKT表達，但隨著濃度增加，p-AKT表達略呈下降趨勢。見圖1-B。

2.2 順鉑誘導ES-2細胞內(nèi)mTOR磷酸化 順鉑以20 μmol/L濃度加入上皮性卵巢癌ES-2細胞上清液中(原上清液中含5% FBS)，結果顯示：作用15 min后，p-mTOR表達明顯增加，30 min最顯著，隨后至120 min時略下降并持續(xù)在一定水平。見圖2-A。將不同濃度順鉑加入上皮性卵巢癌ES-2細胞上清液中(原上清液中含5% FBS)，結果顯示：暴露120 min后，20 μmol/L可顯著增加p-mTOR表達，但隨著濃度增加，p-mTOR表達略呈下降趨勢。見圖2-B。

2.3 Rapamycin抑制SKOV3、ES-2細胞中p-mTOR表達 上皮性卵巢癌SKOV3和ES-2細胞接受Rapamycin作用24 h后，采用IGF-1 50 ng/mL繼續(xù)刺激30 min，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Rapamycin 0.1 μmol/L顯著抑制p-mTOR表達，參照對照組，活性分別下降了83.7%、87.2%，見圖3。

圖1 Western blot檢測不同濃度的順鉑作用ES-2細胞不同時間，p-AKT表達水平的變化

圖2 Western blot檢測不同濃度的順鉑作用ES-2細胞不同時間，p-mTOR表達水平的變化

圖3 Western blot檢測Rapamycin抑制卵巢癌SKOV3、ES-2細胞中p-mTOR表達

2.4 Rapamycin抑制SKOV3、ES-2細胞增殖 采用不同濃度梯度Rapamycin作用細胞，MTT結果提示，Rapamycin抑制SKOV3、ES-2細胞生長，呈濃度依賴性，但其抑制作用相對于Triciribine較弱。見圖4。

圖4 MTT檢測Rapamycin對上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2細胞生長抑制情況

2.5 Rapamycin聯(lián)合順鉑顯著促進上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2細胞凋亡 流式細胞儀分別檢測單獨Rapamycin 100 nmol/L。單獨順鉑20 μmol/L以及兩者聯(lián)合作用對SKOV3、ES-2細胞凋亡率的影響。結果顯示，細胞接受不同因素處理24 h后，聯(lián)合用藥組對兩種細胞的凋亡率均顯著高于單獨順鉑組以及單獨Rapamycin組(P<0.01)。見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測SKOV3、ES-2細胞凋亡率

3 討論

PI3K/AKT信號通路是細胞生存和抗凋亡的重要傳導通路之一，并且與腫瘤的化療耐受關系密切。Kim等[1]報道，紫杉醇可通過下調(diào)PI3K活性，使AKT失活，從而促使細胞凋亡。Abdul等[2]發(fā)現(xiàn)，蒽環(huán)類抗菌藥物(Anthracycline)能夠提高PI3K活性，繼而激活PI3K下游蛋白AKT，從而活化NF-κB，抑制細胞凋亡。Li等[3]研究認為，阿霉素可增加磷酸化AKT及其下游底物GSK-3β、FOXO3α和Bim表達，但大劑量阿霉素也可抑制PI3K/AKT信號通路的激活，從而促進細胞凋亡。Martelli等[4]研究發(fā)現(xiàn)，依托泊苷可激活AKT/NF-κB而延遲細胞凋亡時間，PI3K激酶抑制劑LY294002則可顯著降低癌細胞對依托泊苷的抗性，從而提高細胞對藥物的敏感性。因此，尋找化療激發(fā)的細胞自我保護機制，因勢誘導是克服化療耐藥的根本之道。

目前有關鉑類化合物對PI3K/AKT信號通路的影響的研究結論存在分歧。Westfall等[5]及Zhang等[6]均報道，卡鉑可激活卵巢癌細胞株PI3K信號通路，PI3K抑制劑LY294002可以阻斷此現(xiàn)象，從而增強癌細胞對卡鉑的敏感性。Weir等[7]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過調(diào)節(jié)卵巢癌耐藥細胞株中AKT和p38-MAPK信號轉導，促進細胞G2/M期停滯，逆轉對順鉑的耐受。Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn)，順鉑通過抑制卵巢癌OVCAR3細胞中AKT磷酸化，促進細胞凋亡。本研究結果顯示，20 μmol/L順鉑刺激5 min，上皮性卵巢癌ES-2細胞中p-AKT表達增加，30 min最顯著，隨后至120 min時略下降并持續(xù)在一定水平。采用不同作用濃度的順鉑作用ES-2細胞120 min，結果顯示，順鉑20 μmol/L可顯著增加p-AKT表達，但隨著濃度增加，p-AKT表達略呈下降趨勢，這與卡鉑研究結果相似。本研究結果顯示：20 μmol/L順鉑刺激15 min，ES-2細胞中p-mTOR表達明顯增加，30 min最顯著，隨后至120 min時略下降并持續(xù)在一定水平；不同濃度的順鉑作用于ES-2細胞120 min，20 μmol/L可顯著增加p-mTOR表達，但隨著濃度增加，p-mTOR表達略呈下降趨勢。由此可見，順鉑誘導卵巢上皮性癌ES-2細胞中PI3K/AKT信號通路下游靶位mTOR激活，發(fā)揮著IGF-1樣作用。

雷帕霉素(Rapamycin)是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制抗菌藥物，能選擇性地與胞漿中廣泛存在的FK506結合蛋白(FKBP)高親和力特異性結合，形成Rapamycin-FKBP復合物，該復合物能與胞漿中mTOR蛋白高親和力特異性結合，強烈抑制mTOR激酶活性，使之對下游底物的磷酸化調(diào)節(jié)作用減弱或消失，阻斷各種生長因子轉導的信號下傳[9]。本文結果表明，Rapamycin對SKOV3、ES-2細胞生長抑制的強度明顯低于順鉑，但Rapamycin可顯著增強順鉑促進SKOV3、ES-2細胞凋亡的效應，從而增加細胞對順鉑化療的敏感性。目前研究顯示，mTOR激酶抑制劑對多種惡性腫瘤細胞有明顯抑制作用[10-11]，NVP-BEZ235作為PI3K/mTOR雙重激酶抑制劑，可明顯抑制上皮性透明性細胞癌的增殖[12]，無疑是很有前景的抗腫瘤藥物，同時也預示著在卵巢癌化療中，合理利用信號通路激酶抑制劑，將有利于增強化療效果，可望成為預防和逆轉耐藥的有效途徑。

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Enhanced effects of rapamycin on cisplatin-based chemotherapy in epithelial ovarian cancer cells

ZHANG Hai-yan,SUN Hong*

(Hospital of Obstetrics and Gynecology,Affiliated to Fudan University,Shanghai 200011,China)

Objective To explore the effects of rapamycin or rapamycin combined with cisplatin on cell proliferation and apoptosis in SKOV3 and ES-2 cells.Methods Western blot was used to detect the inhibiting effect of rapamycin on mTOR and the optical concerntration of rapamycin in SKOV3 and ES-2 cells.Methyl thiazolyl tetrazolium and flow cytometry were used to detect the growth rate and early apoptosis rate after cisplatin-based chemotherapy,rapamycin treatment or combination treatment,respectively.Results The activation of mTOR was dramatically inhibited after exposuring to 100 nmol/L rapamycin under normal culture condition(P<0.05).Cisplatin could affect the activation of mTOR signaling pathway of ES-2 cells in epithelial ovarian cancer.Compared with single use of cisplatin and rapamycin,the combination use of the two agents could significantly enhance the early apoptosis rate of SKOV3 and ES-2 cells,and inhibit the proliferation of them (P<0.05).Conclusion mTOR signaling pathway could regulate the cisplatin-based chemotherapy in epithelial ovarian cancer,rapamycin could enhance the killing effect of cisplatin by inhibiting the activation of mTOR.

Epithelial ovarian cancer;mTOR signaling;Rapamycin;Cisplatin

2014-08-29

復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院,上海 200011

國家自然科學基金(81001150)；高等院校教育部博士點基金(20100071120090)；上?？莆t(yī)學引導項目(10411960800)

10.14053/j.cnki.ppcr.201501002

*通信作者