李志喜 胡 明 劉超 楊曉亮

(南京大學化學化工學院，配位化學國家重點實驗室，南京210093)

基于Cyclam衍生物的單核金屬配合物的結(jié)構(gòu)及核酸酶活性

李志喜 胡 明 劉超 楊曉亮＊

(南京大學化學化工學院，配位化學國家重點實驗室，南京210093)

以1，8-二甲基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷為原料，以N，N′-二叔丁氧羰基-2-甲璜酰氧基-1，3-二氨基丙烷為烷基化試劑，合成了cyclam衍生物：1，8-二(N，N′-二叔丁氧羰基-1，3-二氨基異丙基)-4，11-二甲基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(L1)；及其對應的系列單核金屬配合物，Zn(L1)Cl2(1)，Ni(L1)Cl2(2)和Cu(L1)Cl2(3)；核磁結(jié)果表明，L1為C2對稱結(jié)構(gòu)，且cyclam環(huán)上每一個亞甲基碳上的2個氫化學不等價；利用2D[1H，15N]HSQC對比配體配位前后N-H化學位移的變化，確定配合物的結(jié)構(gòu)是金屬與配體cyclam環(huán)上的4個氮原子配位；利用變溫核磁1H NMR和13C NMR，結(jié)合2D[1H，15N]HSQC核磁共振波譜表明，配合物1在溶液中主要以兩種構(gòu)型并存，并主要以trans-Ⅲ構(gòu)型存在。此外，用凝膠電泳研究了配體與單核金屬配合物對超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA切割活性；實驗結(jié)果表明，配合物3在抗壞血酸存在的條件下具有核酸酶活性，而配體(L1)，配合物1和配合物2在實驗條件下，無論是氧化切割還是水解切割都顯陰性。

Cyclam衍生物；單核金屬配合物；構(gòu)型；人工核酸酶

大環(huán)多胺化合物與許多金屬離子有良好的結(jié)合能力，通常在結(jié)合過程中伴隨著大環(huán)的構(gòu)型變化[1-2]。Cyclam(1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷)是最常用的大環(huán)多胺之一，也是配位化學領域中使用最為廣泛的配體之一。Cyclam衍生物在與金屬的結(jié)合過程中，由于N-取代基空間分布的不同，會產(chǎn)生五種可能的構(gòu)型：RSRS、RSRR、SSRR、RSSR以及RRRR，分別命名為trans-Ⅰ～trans-Ⅴ[3]。

近年來，金屬小分子化合物作為DNA的切割試劑得到廣泛的研究[4-5]，特別是人工水解切割酶的設計與合成，因為水解切割除了能得到含有粘性末端的斷裂產(chǎn)物外，同時還具有高選擇性、高效率的特點[6-7]。而大環(huán)多胺類的銅，鋅和鎳配合物被用于人工核酸酶研究，具有良好的DNA切割活性[8-10]。

為了尋求有效的cyclam衍生物的金屬人工核酸酶，本文以1，8-二甲基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷為原料，N，N′-二叔丁氧羰基-2-甲璜酰氧基-1，3-二氨基丙烷為烷基化試劑，合成得到了cyclam衍生物：1，8-二(N，N′-二丁氧羰基-1，3-二氨基異丙基)-4，11-二甲基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(L1)；及其對應的系列單核金屬配合物：Zn(L1)Cl2(1)，Ni(L1)Cl2(2)和Cu(L1)Cl2(3)；利用1H、13C NMR及2D[1H，15N]HSQC對比配體和配合物側(cè)鏈N-H化學位移的變化，確定了配合物的結(jié)構(gòu)是金屬與cyclam環(huán)上的4個N進行配位；利用變溫核磁1H NMR和13C NMR，結(jié)合2D[1H，15N]HSQC核磁共振波譜表明，配合物1在溶液中以2種構(gòu)型并存，并主要以trans-Ⅲ構(gòu)型存在。用凝膠電泳研究了配體和單核金屬配合物對超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA切割活性。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

常用化學試劑例如：乙酸乙酯，甲醇，二氯甲烷，乙腈，二甲基亞砜，乙醚，異丙醇，丙酮，三乙胺，碳酸鉀，氯化鈉，石油醚，正己烷，硫酸鈉，水合氯化銅，水合氯化鎳，碳酸氫鈉，氯化鋅等為分析純，均從試劑公司購得，使用前未做進一步純化。其中無水二氯甲烷，無水三乙胺和無水乙腈是在氫化鈣存在下，回流數(shù)小時進行無水處理。1，8-二甲基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷購自Aldrich公司，1，3-二氨基-2-丙醇購自安耐吉公司。紅外光譜在Bruker VECTOR 22紅外光譜儀上測定(4 000～400 cm-1，KBr壓片)。1H NMR、13C NMR均在Bruker AVANCEⅢ600核磁儀上測定(298.5 K)，變溫13C NMR在Bruker AVANCEⅢ400核磁儀上測定。電噴霧質(zhì)譜在LCQ電噴霧質(zhì)譜儀(ESI-MS，F(xiàn)innigan)上測定，配合物的組成通過比較實測同位素峰形和ISOPRO 3.0程序的模擬峰形確定。

1.2 L1的合成

配體L1的合成路線如Scheme 1所示，其中烷基化試劑A1按文獻方法[11]在本實驗室合成得到。配體L1按文獻方法合成[12]，在100 mL的三頸瓶中，依次稱取1，8-二甲基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(1.0 g，4.4 mmol)，無水碳酸鉀(2.0 g，14.0 mmol)，KI(1.5 g，9.3 mmol)，烷基化試劑A1(3.6 g，9.6 mmol)，加入無水乙腈(100.0 mL)，氮氣保護下回流48 h。冷卻后過濾，真空濃縮后得到黃色油狀液體。柱層析分離：=100∶10∶0.2)(硅膠300～400目)。濃縮得白色固體，收率：15%。L1的高分辨質(zhì)譜：m/z=795.5685[L1+Na]+(Found)，m/z=795.568 4[L1+Na]+(Calcd.)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：3.40(bs，2H，-CH)，3.05～3.09(d，4H，CH2NHBoc)，2.54(d，2H，α-CH2),2.58(s,2H,CH2NHBoc),2.53(s,4H，α-CH2)，2.36(m, 4H，α-CH2),2.23(2H,d，α-CH2),2.21(s,2H，CH2NHBoc)，2.17(s，6H，NCH3)，1.75(bs，2H，β-CH2)，1.51(bs，2H，β-CH2)，1.37(s，36H，C(CH3)3)。13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：156.41，155.91，77.86，54.96,53.04,52.31, 51.65，49.40，48.53，43.83，42.08，28.73，28.66，24.74。紅外光譜(KBr壓片)：3385，2970，2795，1 691,1 513, 1 369，1 171 cm-1。

Scheme 1Synthesis of L1

1.3 單核金屬配合物的合成[13]與表征

分別將ZnCl2(0.15 mmol)，NiCl2·2.5H2O(0.15 mmol)和CuCl2·2H2O(0.15 mmol)與L1(0.05 mmol)溶于甲醇(5.0 mL)中，回流4 h，將混合溶液濃縮至1.0 mL，將其滴加到乙醚中，離心，干燥，得灰色粉末Zn(L1)Cl2(1)，深綠色粉末Ni(L1)Cl2(2)和深藍色粉末Cu(L1)Cl2(3)。對于鎳和銅配合物，由于順磁性的影響，對其進行表征主要利用電噴霧質(zhì)譜。

配合物1(ZnC38H76N8O8Cl2)的電噴霧質(zhì)譜：m/z=873.7[1-Cl]+，m/z=835.7[1-2Cl+H]+。1的1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：1.31～1.52(m，40H)，1.55～2.46(m，16H)，2.54～3.32(m，16H)。紅外光譜(KBr壓片)：3 445，2 989，1 687，1 633，1 145，1 070，535 cm-1。

配合物2(NiC38H76N8O8Cl2)的電噴霧質(zhì)譜：m/z= 865.5[2-Cl]+，m/z=830.5[2-2Cl-H]+。紅外光譜(KBr壓片)：3 354，2 982，2 926，1 703，1 518，1 368，1 252，1 171 cm-1。

配合物3(CuC38H76N8O8Cl2)的電噴霧質(zhì)譜：m/z= 871.3[3-Cl]+，m/z=835.3[3-2Cl-H]+。紅外光譜(KBr壓片)：3424,2978,1678,1633,1127,1043,533 cm-1。

圖1 配合物1～3的ESI-MS與程序模擬峰Fig.1 ESI-MS spectra of complexes 1～3 in a methanol solution

1.4 配體與單核金屬配合物的對DNA的切割實驗

以超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA為底物，Tris-HCl電泳緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl/50 mmol·L-1NaCl，pH 7.4)的水溶液介質(zhì)中，分別考察了配體和單核金屬配合物對DNA的切割活性。實驗條件為：DNA的濃度為200 ng·L-1，實驗溫度為37℃或55℃，在電泳分離前，底物與各化合物孵化1 h或6 h，抗壞血酸的物質(zhì)的量為化合物的100倍。每份樣品利用凝膠電泳分析結(jié)果，用UVP凝膠成像系統(tǒng)完成電泳圖的成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 L1的結(jié)構(gòu)研究

圖2 配體L1的13C譜(600 MHz,DMSO-d6)Fig.2 13C NMR spectrum of L1(600 MHz,DMSO-d6)

圖3 配體L1的2D[1H,13C]HSQC譜(600 MHz,DMSO-d6)Fig.3 2D[1H,13C]HSQC spectrum of L1(600 MHz, DMSO-d6)

在合成得到配體L1后，其結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、MS、1H NMR、13C NMR及2D NMR進行確定，該化合物的核磁共振氫譜共有10組峰，碳譜共有14組峰(圖2)，據(jù)此可以推測L1呈C2對稱結(jié)構(gòu)；在其2D[1H，13C]HSQC(圖3)中，結(jié)合2D COSY，通過對配體L1歸屬可發(fā)現(xiàn)，配體L1的cyclam環(huán)上的每一個亞甲基碳上的2個氫都是化學不等價；在側(cè)鏈上，同側(cè)1，3-位2個亞甲基的1H，13C(3.06/42.08，2.21/48.53)化學位移也不相同。

2.2 配合物1的配位點及構(gòu)型研究

2.2.1 2D[1H，15N]HSQC對配合物1配位點的研究

早期對于cyclam衍生物的金屬配合物構(gòu)型研究時，通常選用未經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的cyclam或用橋連基團將cyclam環(huán)固定而得到的衍生物為模板，利用核磁滴定或通過合成的方法得到其金屬配合物，來研究溶液狀態(tài)下不同金屬以及同種金屬不同陰離子的條件下cyclam衍生物金屬配合物的構(gòu)型問題[3,14]。本研究中單核鋅配合物1由配體L1與ZnCl2反應得到。在圖4中比較配合物1和配體L1的1H NMR可以看到：配合物1 cyclam環(huán)上的烷基峰信號(3.9～1.9)和配體相比，有很大的改變，其中N-Me化學位移由2.17向低場移至2.42，而側(cè)鏈上的烷基氫及氮氫化學位移變化不大；配合物1的13C NMR中，cyclam環(huán)上的烷基碳的化學位移分別是：61.46，62.30(C2)；44.37，44.60(C3)；57.85，57.53(C4)；51.50(C5)；55.40，55.08(C9)。與對應的配體L1的54.96(C2)；43.83(C3)；51.65(C4)；52.32(C5)；53.04(C9)相比明顯的向低場移動。核磁共振氫譜、碳譜均表明鋅是與cyclam環(huán)上的氮原子進行配位；為了進一步研究配合物的配位點，我們利用2D[1H，15N]HSQC核磁技術(shù)，對比配體在配位前后N-H化學位移的變化來研究其配位點。在配體L1的2D[1H，15N]HSQC (圖5)中，因側(cè)鏈化學環(huán)境的不同，可以看到2組交叉峰，即H1(7.01，79.65)和H2(6.90，90.47)，分別對應為側(cè)鏈1，3-位亞甲基相連的2個Boc保護的伯胺氮原子上的氫；而在配合物1的2D[1H，15N]HSQC中,可以看到3個交叉峰，即H1(7.07,80.33)，H2(6.94, 79.96)，以及H3(6.98，94.22)，通過對比可以發(fā)現(xiàn)，配體L1在配位前后，其側(cè)鏈15N和1H的化學位移都未發(fā)生明顯變化，因此可以推測金屬鋅在與配體L1進行配位時，其側(cè)鏈的N并未參與配位，此外根據(jù)N-H相關(guān)峰的組數(shù)，也可以發(fā)現(xiàn)配合物1呈一個對稱的結(jié)構(gòu)，結(jié)合Zn的配位特點(四配位，五配位和六配位)，可推測配合物1的結(jié)構(gòu)是金屬Zn是與cyclam環(huán)上的4個N進行配位。

圖4 配合物1與配體L1的1H NMR譜(600 MHz, DMSO-d6)Fig.4 Compare of1H NMR of complex 1 and L1(600 MHz,DMSO-d6)

圖5 配體L1和配合物1的2D[1H,15N]HSQC(600 MHz,DMSO-d6)Fig.5 2D[1H,15N]HSQC spectrum of L1and complex 1(600 MHz,DMSO-d6)

Cyclam衍生物在與金屬的結(jié)合過程中，由于N取代基空間分布的不同，在溶液中，金屬配合物會以多種構(gòu)型共存。而當溫度逐漸升高時，構(gòu)型之間就會發(fā)生轉(zhuǎn)換而趨向于形成熱力學最為穩(wěn)定的構(gòu)型[15]，因此可以利用變溫核磁進行實時原位的跟蹤，來研究溶液中配合物的構(gòu)型之間的轉(zhuǎn)換。在圖4中，比較配合物1在不同溫度下的的1H NMR譜可以看出：當溫度升高到70℃時，配合物的耦合裂分由于構(gòu)型的轉(zhuǎn)換而更加清晰。進一步利用變溫核磁碳譜驗證了配合物在溶液中以多種構(gòu)型的共存。從圖6碳譜上可以明顯看到，隨著溫度的升高，碳譜峰的組數(shù)逐漸減少，最后以一個熱力學最為穩(wěn)定的構(gòu)型存在。根據(jù)配合物的結(jié)構(gòu)特點，結(jié)合2D[1H，15N]HSQC，在配體L1的2D[1H，15N]HSQC中，由于側(cè)鏈化學環(huán)境的不同，可以看到兩組交叉峰，分別為側(cè)鏈1，3-位亞甲基相連的2個Boc保護的伯胺氮原子上的氫；在配合物1的2D[1H，15N]HSQC中，有3個交叉峰，可能存在一種主要構(gòu)型，據(jù)文獻可以推測該構(gòu)型為trans-Ⅲ(圖7)構(gòu)型[16]。

圖6 配合物1在不同溫度下的13C NMR譜(400 MHz, DMSO-d6)Fig.6 13C NMR spectrum of complex 1 at different temperature(400 MHz,DMSO-d6)

圖7 cyclam衍生物的trans-Ⅰ～trans-Ⅴ構(gòu)型Fig.7 trans-Ⅰ～trans-ⅤConfiguration of cyclam derivatives

2.3 配體和金屬配合物對DNA的切割

金屬小分子化合物作為DNA的切割試劑得到廣泛的研究，特別是人工水解切割酶的設計與合成。以超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA為底物，在Tris-HCl電泳緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl/50 mmol·L-1NaCl，pH 7.4)的水溶液介質(zhì)中，分別考察了配體和金屬配合物對DNA的切割活性。通過實驗發(fā)現(xiàn)，配合物3在抗壞血酸存在的條件下具有核酸酶活性，其切割的機理可能是[17]：Cu得到一個電子形成Cu，Cu在化學還原試劑(抗壞血酸)存在下與氧分子反應生成超氧自由基，與DNA的磷酸二酯鍵發(fā)生氧化還原反應，使磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂；而配體(L1)，配合物1和配合物2在實驗條件下，無論是氧化切割還是水解切割都顯陰性，對于配合物1和配合物2，分析可能是因為cyclam環(huán)上的4個N與金屬配位后，由于N的給電子效應降低了金屬的路易斯酸性，使其在實驗條件下不能有效的降低中心原子的電荷密度，從而對DNA無論是氧化切割還是水解切割都顯陰性；基于此假設，我們通過改變cyclam環(huán)上的取代基，設計合成了系列單核鋅的金屬配合物，在對其核酸酶活性研究中發(fā)現(xiàn)，當cyclam環(huán)上的N為吸電子取代基時，其對應的鋅配合物表現(xiàn)出核酸酶活性，目前這部分工作還在整理過程中。

圖8 pBR322(200 ng·μL-1)質(zhì)粒DNA與L1(a),1(b), 2(c)和3(d)的凝膠電泳圖Fig.8 Agarose gel electrophoresis for cleavage of the pBR322 plasmid DNA(200 ng·μL-1)by L1(a), 1(b),2(c)and 3(d)

3 結(jié)論

本研究以1，8-二甲基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷為原料，以N，N′-二叔丁氧羰基-2-甲璜酰氧基-1，3-二氨基丙烷為烷基化試劑，合成得到了cyclam衍生物配體L1以及其對應的系列單核金屬配合物：Zn(L1)Cl2(1)，Ni(L1)Cl2(2)和Cu(L1)Cl2(3)；核磁結(jié)果表明，L1為C2對稱結(jié)構(gòu)，且cyclam環(huán)上每一個亞甲基碳上的2個氫化學不等價；利用2D[1H，15N]HSQC對比配體在配位前后，N-H化學位移的變化，確定配合物的結(jié)構(gòu)是金屬與配體cyclam環(huán)上的4個N進行配位；利用變溫核磁，結(jié)合2D[1H，15N]HSQC，發(fā)現(xiàn)配合物1在溶液中以2種構(gòu)型并存，并主要以trans-Ⅲ構(gòu)型存在。此外用凝膠電泳研究了配體與單核金屬配合物對超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA切割活性。發(fā)現(xiàn)配合物3在抗壞血酸存在的條件下具有核酸酶活性，而配體L1，配合物1和配合物2在實驗條件下，無論是氧化切割還是水解切割都顯陰性。對于配合物1和配合物2，分析可能是因為cyclam環(huán)上的4個N與金屬配位，由于N的給電子效應降低了金屬的路易斯酸性，使其在實驗條件下不能有效的降低中心原子的電荷密度，從而對DNA無論是氧化切割還是水解切割都顯陰性，該研究結(jié)果可為以cyclam衍生物為基礎的人工核酸酶的設計與合成提供一定的參考。

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Structural Characterization and Artificial Nuclease Activity of Transition Metal Complexes of Cyclam Derivatives

LI Zhi-XiHU MingLIU ChaoYANG Xiao-Liang＊
(State Key Laboratory of Coordination Chemistry,Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University,Nanjing 210093,China)

A cyclam-based ligand:tetratert-butyl((4,11-dimethyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,8-diyl)bis (propane-3,2,1-triyl))tetracarbamatev(L1),and its metal complexes[Zn(L1)Cl2](1),[Ni(L1)Cl2](2)and[Cu(L1)Cl2] (3)were designed and synthesized.L1has a C2 symmetrical structure and the1H chemical shift of the same carbon was different because of the influence of cyclam ring.The metal binding site of the L1was confirmed by 2D[1H,15N]HSQC by comparing the chemical shift of N of the branched chains of the ligand that of with the corresponding metal complex.The co-existence of two configuration was characterized by13C VT NMR combined with 2D[1H,15N]HSQC NMR and trans-Ⅲwas confirmed to be the main configuration for complex 1.The cleavage activity of the ligand L1and the complexes 1～3 was investigated in detail under physiological conditions.Agarose gel electrophoresis experiments showed that the complex 3 possesses interesting nuclease activity in the present of ascorbate;No matter the hydrolysis or oxidation,the ligand L1and complex 1,and 2 were negative to DNA at the experimental conditions.

cyclam derivatives;mono-metal complex;configuration;artificial nuclease

O614.24+1；O614.81+3；O614.121

A

1001-4861(2015)01-0127-06

10.11862/CJIC.2015.023

2014-08-11。收修改稿日期：2014-10-24。

國家自然科學基金(No.21131003)資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：yxlnmr@nju.edu.cn