張 靜，高 潔，武莎斐，魯 濤，梁智勇

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京100730

腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌的臨床病理特征及表皮生長因子受體基因狀態(tài)

張 靜，高 潔，武莎斐，魯 濤，梁智勇

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京100730

目的 探討腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌臨床病理特征及其表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)蛋白表達、基因突變和基因拷貝數(shù)改變情況。方法 回顧性分析2000年1月至2009年12月在北京協(xié)和醫(yī)院手術(shù)切除的9例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌的臨床特點、組織形態(tài)學特征，并以9例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)腺瘤為對照，應用免疫組織化學、Scorpion ARMS突變系統(tǒng)及熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)的方法分析EGFR在二者中的蛋白表達、基因突變和基因拷貝數(shù)改變的情況。結(jié)果 9例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中，Cushing綜合征2例，無功能性皮質(zhì)癌7例。病例隨訪時間6～56個月，皮質(zhì)癌患者失訪2例，死亡6例。腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中EGFR蛋白過表達率為77.8%(7/9)，EGFR FISH陽性率為55.6% (5/9);僅有22.2% (2/9)皮質(zhì)腺瘤存在EGFR蛋白的表達，且EGFR FISH均為陰性。腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)腺瘤及皮質(zhì)癌中均未檢測出EGFR基因擴增及基因突變。結(jié)論 腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌非常罕見，其診斷依據(jù)病理學及免疫表型，EGFR蛋白過表達和7號染色體的高多體性較腺瘤更常見，可能有助于與后者的鑒別診斷，也有可能成為今后臨床分子靶向治療的潛在方向。

腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌;表皮生長因子受體;免疫組化;熒光原位雜交;基因突變

Med J PUMCH，2015，6(3):191－196

腎上腺皮質(zhì)癌是起源于腎上腺皮質(zhì)的少見惡性上皮性腫瘤，而嗜酸細胞型皮質(zhì)癌 (adrenocortical oncocytic carcinoma)是其中一個非常罕見的亞型，迄今為止國外報道26例［1-8］，國內(nèi)報道僅10例［9-10］，多以個案報道居多，臨床對該病認識尚不足，且對于該類腫瘤的分子遺傳學研究也甚少。近年來研究表明表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)在肺癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中過表達，且與不良預后相關(guān)［11-12］。腎上腺皮質(zhì)癌中 EGFR基因狀態(tài)鮮有報道［13-14］，目前尚未見研究報道腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中EGFR基因狀態(tài)。本研究回顧性納入北京協(xié)和醫(yī)院10年間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌患者9例，總結(jié)其臨床特點、組織形態(tài)學特征，并應用免疫組化、Scorpion ARMS突變系統(tǒng)及熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)的方法分析EGFR在該類腫瘤中的蛋白表達、基因突變和基因拷貝數(shù)改變情況，以提高對其認識。

材料和方法

標本來源

2000年1月至2009年12月在北京協(xié)和醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的腎上腺皮質(zhì)腫瘤共989例，由有經(jīng)驗的病理醫(yī)師重新閱片審核證實為腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌9例，選取同時期9例嗜酸細胞型皮質(zhì)腺瘤作為對照。查閱病例資料，收集包括年齡、性別、手術(shù)信息、組織學特征、臨床分期及預后等信息。

免疫組織化學染色

手術(shù)切除標本均由中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm涂膠切片。EGFR染色采用DAKO EGFR pharmDxTM試劑盒，操作步驟參照使用說明書，主要反應步驟:室溫0.3%H2O2孵育10 min，蛋白酶K抗原修復5 min，一抗?jié)窈兄惺覝胤跤?0 min，二抗同條件下孵育45 min。免疫組化判讀標準:＞10%的腫瘤細胞出現(xiàn)棕黃色胞膜著色定義為陽性，根據(jù)陽性細胞的比例和強度記錄為:弱陽性+，中度陽性++，強陽性+++。

基因突變檢測

使用英國Dlivering Pharmacogenomics公司推出的EGFR突變檢測試劑盒 (EGFR Scorpion Kit)。該試劑盒針對外顯子第18、19、20和2l的常見突變類型設(shè)計了9組檢測探針，同時設(shè)計相應的基因野生型檢測探針，可以檢測29種EGFR突變。使用ABI 7500 PCR儀進行即時PCR擴增，PCR條件為95℃變性10 min; 95℃30 s，61℃1 min，循環(huán)40次。反應結(jié)束后即時PCR儀自動以擴增曲線的形式輸出結(jié)果。結(jié)果根據(jù)EGFR突變檢測試劑盒的使用說明書進行判讀。

熒光原位雜交檢測

石蠟預處理試劑盒Ⅱ及EGFR檢測探針LSI EGFR Spectrmn Orange/CEP Spectrum Green均購自 Vysis公司。FISH主要步驟:(1)石蠟切片56℃烤片過夜，常規(guī)脫蠟，預處理溶液中80℃處理10 min，蛋白酶溶液中消化15 min，依次經(jīng)75%、85%和90%乙醇脫水后自然干燥;(2)取10μl探針混合液滴于切片組織上;(3)次日取出標本，去除橡膠水泥，在2×SSC/ 0.3%NP40洗脫液中73℃洗滌3 s，再于室溫下洗滌5 s，自然干燥;(4)DAPI對比染色，在 Olympus BX51熒光顯微鏡下通過特異性濾光片觀察，計數(shù)，應用VideoTest軟件進行圖像合成分析。結(jié)果判讀:根據(jù)Cappuzzo等［15］的標準進行結(jié)果判斷，隨機計數(shù)60個腫瘤細胞。EGFR為紅色信號，7號染色體著絲粒為綠色信號，計算紅色信號和綠色信號比值，高多體性(high polysomy)和基因擴增 (gene amplification)為FISH陽性，而二體性 (disomy)、低三體性 (low trisomy)、高三體性 (high trisomy)、低多體性 (low polysomy)為FISH陰性。

結(jié)果

臨床資料

研究期間腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌病例占同期連續(xù)收治的腎上腺皮質(zhì)腫瘤病例的0.9% (9/989)。腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌患者中，男性3例，女性6例;平均年齡為42.9歲。多數(shù)腫瘤位于右側(cè)，僅1例發(fā)生在左側(cè);大部分為無功能性皮質(zhì)癌，有2例患者臨床上表現(xiàn)為Cushing綜合征。經(jīng)隨訪觀察，4例患者發(fā)生腹壁、腎臟、脾臟等器官的轉(zhuǎn)移。病例隨訪時間6～56個月，2例患者失訪，余患者多數(shù)預后不良，6例患者在術(shù)后12～48個月后死于腫瘤，另1例患者術(shù)后32個月尚存活 (表1)。

腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌大體及鏡下觀察

腫瘤多數(shù)體積較大，呈結(jié)節(jié)狀，最大直徑4～ 21 cm，常有包膜，僅少數(shù)與周圍組織境界不清，切面呈棕黃色或多彩狀，質(zhì)較軟，常伴出血、壞死、纖維化瘢痕，可有囊性變及鈣化。大部分腫瘤細胞體積大，呈多角形，大多呈嗜酸性，透明細胞稀少或全無，細胞核有不同程度的異型性，可見明顯核仁，核分裂象多少不等，可見瘤巨細胞 (圖1)。少部分區(qū)域瘤細胞呈梁狀或巢狀排列，其間可見豐富的血竇，但大部分呈彌漫分布，部分病例脈管內(nèi)可見瘤栓。腫瘤細胞可浸潤包膜、周圍脂肪及神經(jīng)組織 (表2)。

圖1 腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌細胞呈彌漫分布，核異型性明顯，胞質(zhì)嗜酸性，可見核分裂 (HE，×100)

表1 9例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌臨床特點

表2 9例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌病理組織學特征

EGFR在腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌及腺瘤中蛋白表達、基因突變和基因拷貝數(shù)改變情況

EGFR蛋白在7例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中呈中-強的胞膜著色 (7/9，77.8%)(圖2)，2例呈陰性;僅2例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)腺瘤呈弱的胞膜著色 (2/9，22.2%)，余7例均為陰性。EGFR在嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中的表達率及表達強度均明顯高于腺瘤 (表3)。

9例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌及9例嗜酸細胞型皮質(zhì)腺瘤均未顯示 EGFR擴增，但5例皮質(zhì)癌 (5/9，55.6%)顯示高多體性 (圖3)，2例 (2/9，22.2%)呈低三體性，余2例 (2/9，22.2%)為二體性;然而，皮質(zhì)腺瘤未顯示高多體性，2例 (2/9，22.2%)呈低多體性，2例 (2/9，22.2%)呈二體性，余5例示 (5/9，55.6%)呈低三體性 (表3)。與皮質(zhì)腺瘤相比，皮質(zhì)癌中EGFR高多體性更常見。皮質(zhì)癌EGFR FISH陽性率為55.6%(5/9)，皮質(zhì)腺瘤EGFR FISH均為陰性。

本組病例中均未發(fā)現(xiàn)EGFR外顯子18～21的突變，所有嗜酸細胞型皮質(zhì)癌及腺瘤均顯示野生型(圖4)。

圖2 表皮生長因子受體在腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中呈強陽性 (+++)，腫瘤細胞膜呈棕黃色 (免疫組織化學，×100)

表3 表皮生長因子受體在腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌及腺瘤中蛋白表達、基因突變和基因拷貝數(shù)改變情況

圖3 腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中表皮生長因子受體基因拷

圖4 腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中未檢測到表皮生長因子受體突變，紅色曲線代表陽性對照

討論

腎上腺皮質(zhì)腫瘤中最常見為皮質(zhì)腺瘤，而腎上腺皮質(zhì)癌尤其是嗜酸細胞型皮質(zhì)癌甚為罕見，回顧國內(nèi)外文獻至今報道共不足40例，且對于該類腫瘤的分子遺傳學研究也甚少，本研究收集了本院9例腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌，總結(jié)其臨床病理學特征，并分析了EGFR在該類腫瘤中的蛋白表達、基因突變和基因拷貝數(shù)改變的情況。

腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌的診斷，關(guān)鍵在于其良惡性鑒別。根據(jù)Weiss系統(tǒng)，具備以下4個或4個以上條件即可診斷腎上腺皮質(zhì)癌:細胞核異型性大，＞75%瘤細胞有嗜酸性胞漿，＞33%彌漫結(jié)構(gòu)，有壞死，核分裂 ＞5/50高倍視野 (high power fields，HPFs)，有異常核分裂、包膜侵犯、血管侵犯及竇隙侵犯［16］。該系統(tǒng)主要針對腎上腺系統(tǒng)非嗜酸性腫瘤，因為多數(shù)嗜酸細胞型皮質(zhì)腫瘤具有細胞核異型性大，＞75%瘤細胞有嗜酸性胞漿，＞33%彌漫結(jié)構(gòu)的特點。2004年Bisceglia等［4］對Weiss系統(tǒng)進行修訂，提出新的評分標準，建議:(1)在嗜酸細胞型皮質(zhì)腫瘤中若存在以下主要條件之一，即較多核分裂 (＞5/50HPFs)、異常核分裂和靜脈侵犯，應診斷為癌;(2)若存在以下次要條件之一，即較大的體積和/或重量 (＞10 cm和/或＞200 g)，有壞死、小血管或竇隙浸潤，應歸為不確定惡性潛能的腫瘤; (3)缺乏以上主要及次要條件提示為良性腺瘤。本組病例應用該標準進行良惡性判斷。

EGFR的異常活化，可引起細胞的增殖、分化，血管的生成及細胞的轉(zhuǎn)移［11］。有文獻報道EGFR蛋白在腎上腺皮質(zhì)癌中存在過表達［13-14，17］，但尚未見文獻報道其在腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)腫瘤中的表達情況。本研究結(jié)果顯示EGFR在嗜酸細胞型皮質(zhì)癌中的表達率及表達強度明顯高于腺瘤，這與EGFR在腎上腺皮質(zhì)癌中表達高于腺瘤的情況較一致［14，18］。有研究報道EGFR陽性表達提示腎上腺皮質(zhì)腫瘤具有惡性傾向，提示EGFR蛋白可能是區(qū)分良惡性腎上腺皮質(zhì)腫瘤的一個有價值的標志物［17］。

靶向EGFR基因突變的酪氨酸激酶抑制劑 (如吉非替尼、厄羅替尼等)已經(jīng)應用于非小細胞肺癌患者，并獲得良好的療效。Kotoula等［19］在35例腎上腺皮質(zhì)癌中檢測出4例腫瘤 (11.4%)存在EGFR基因突變，但是本研究及先前的研究均未檢測出EGFR基因突變，其原因可能是Kotoula等應用直接測序的方法，可以檢測出所有已知和未知的突變，而本研究所應用的檢測方法僅能檢測出29種已知常見的突變位點。

EGFR基因拷貝數(shù)的改變可見于多種惡性腫瘤，包括非小細胞肺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌及頭頸部鱗癌，但在腎上腺皮質(zhì)癌中的改變鮮有報道。本研究組曾對腎上腺皮質(zhì)癌的 EGFR基因拷貝數(shù)進行研究［14］，本研究結(jié)果與其一致，嗜酸細胞型皮質(zhì)癌及腺瘤均未見EGFR擴增，但EGFR高多體性更常見于腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌，而腺瘤中多表現(xiàn)為二體性及低三體性。希望今后能進一步積累病例，分析癌與腺瘤EGFR基因拷貝數(shù)的差異性改變，及其與臨床病理的關(guān)系。

總之，腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌是一種罕見腫瘤，本研究結(jié)果顯示EGFR蛋白過表達及7號染色體高多體性常見于嗜酸細胞型皮質(zhì)癌，提示其可能作為區(qū)分良惡性腎上腺皮質(zhì)腫瘤有價值的標志物。今后可通過積累病例進一步研究EGFR基因在腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)腫瘤中的狀態(tài)，希望為將來該腫瘤的臨床分子靶向治療提供潛在方向。

［1］Wong DD，Spagnolo DV，Bisceglia M，et al．Oncocytic adrenocortical neoplasms-a clinicopathologic study of 13 new cases emphasizing the importance of their recognition［J］．Hum Pathol，2011，42:489-499．

［2］Ohtake H，Kawamura H，Matsuzaki M，et al．Oncocytic adrenocortical carcinoma［J］．Ann Diagn Pathol，2010，14: 204-208．

［3］Thway K，Olmos D，Shah C，et al．Oncocytic adrenal cortical carcinosarcoma with pleomorphic rhabdomyosarcomatous metastases［J］．Am J Surg Pathol，2012，36:470-477．

［4］Bisceglia M，Ludovico O，Di Mattia A，et al．Adrenocortical oncocytic tumors:report of 10 cases and review of the literature［J］．Int J Surg Pathol，2004，12:231-243．

［5］Song SY，Park S，Kim SR，et al．Oncocytic adrenocortical carcinomas:a pathological and immunohistochemical study of four cases in comparison with conventional adrenocortical carcinomas［J］．Pathol Int，2004，54:603-610．

［6］Hoang MP，Ayala AG，Albores-Saavedra J．Oncocytic adrenocortical carcinoma:a morphologic，immunohistochemical and ultrastructural study of four cases［J］．Mod Pathol，2002，15:973-978．

［7］Mearini L，Del Sordo R，Costantini E，et al．Adrenal oncocytic neoplasm:a systematic review［J］．Urol Int，2013，91:125-133．

［8］Erickson LA，Rivera M，Zhang J．Adrenocortical carcinoma: review and update［J］．Adv Anat Pathol，2014，21: 151-159．

［9］許敬平，吳大為，黃江梅，等．腎上腺皮質(zhì)嗜酸細胞癌7例臨床病理分析［J］．臨床與實驗病理學雜志，2013，29:765-767．

［10］潘敏鴻，張新華，馬恒輝，等．腎上腺嗜酸細胞型皮質(zhì)癌臨床病理觀察 ［J］．診斷病理學雜志，2007，14: 423-426．

［11］Normanno N，De Luca A，Bianco C，et al．Epidermal growth factor receptor(EGFR)signaling in cancer［J］．Gene，2006，366:2-16．

［12］Sibilia M，Kroismayr R，Lichtenberger BM，et al．The epidermal growth factor receptor:from development to tumorigenesis［J］．Differentiation，2007，75:770-787．

［13］Adam P，Hahner S，Hartmann M，et al．Epidermal growth factor receptor in adrenocortical tumors:analysis of gene sequence，protein expression and correlation with clinical outcome［J］．Mod Pathol，2010，23:1596-1604．

［14］Zhang J，Wang C，Liang Z，et al．Adrenal cortical neo-plasms:a study of clinicopathological features related to epidermal growth factor receptor gene status［J］．Diagn Pathol，2014，9:19．

［15］Cappuzzo F，Hirsch FR，Rossi E，et al．Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer［J］．J Natl Cancer Inst，2005，97:643-655．

［16］Weiss LM，Medeiros LJ，Vickery AL．Pathologic features of prognostic significance in adrenocortical carcinoma［J］．Am J Surg Pathol，1989，13:202-206．

［17］Kamio T，Shigematsu K，Sou H，et al．Immunohistochemical expression of epidermal growth factor receptors in human adrenocortical carcinoma［J］．Hum Pathol，1990，21: 277-282．

［18］Nakamura M，Miki Y，Akahira J，et al．An analysis of potential surrogate markers of target-specific therapy in archival materials of adrenocortical carcinoma［J］．Endocr Pathol，2009，20:17-23．

［19］Kotoula V，Sozopoulos E，Litsiou H，et al．Mutational analysis of the BRAF，RAS and EGFR genes in human adrenocortical carcinomas［J］．Endocr Relat Cancer，2009，16: 565-572．

Clinicopathological Features and Epidermal Growth Factor Receptor Gene Status of Adrenocortical Oncocytic Carcinoma

ZHANG Jing，GAO Jie，WU Sha-fei，LU Tao，LIANG Zhi-yong

Department of Pathology，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

ObjectiveTo explore the clinicopathological features of adrenocortical oncocytic carcinoma and protein expression，gene mutation，and gene copy number alteration of epidermal growth factor receptor (EGFR)in this carcinoma．MethodsWe reviewed the clinical and histomorphological features of 9 adrenocortical oncocytic carcinoma cases who received surgical resection in the period of January 2000 to December 2009 in Peking Union Medical College Hospital，and 9 adenoma cases were included as control．EGFR protein expression，EGFR gene mutation and EGFR gene copy number alteration in both groups were detected by immunohistochemistry，Scorpion Amplification Refractory Mutation System(ARMS)，and fluorescence in situ hybridization (FISH)，respectively．ResultsThe 9 cases of adrenocortical oncocytic carcinomas included 2 cases of Cushing's syndrome and 7 cases of nonfunctional cortical carcinoma．All cases were followed up for 6 to 56 months，and 2 patients with adrenocortical oncocytic carcinomas lost to follow-up，and 6 died．In the adrenocorti-cal oncocytic carcinoma patients，EGFR overexpression was found in 77.8%(7/9)，and EGFR FISH was positive in 55.6%(5/9)．In contrast，only 22.2%(2/9)of the adrenocortical adenoma patients showed EGFR weak expression and none had positive FISH result．No EGFR gene amplification or mutation was found in the 2 groups of patients．ConclusionsAdrenocortical oncocytic carcinoma is rare．EGFR overexpression and chromosome 7 polysomy are frequent abnormality in the adrenocortical oncocytic carcinomas，which may be used in the differential diagnosis．Also，an investigation of the gene status of EGFR should facilitate the identification of a target therapeutic regimen for carcinoma patients．

adrenocortical oncocytic carcinoma;epidermal growth factor receptor;immunohistochemistry;fluorescence in situ hybridization;gene mutation

LIANG Zhi-yong Tel:010-69159369，E-mail:liangzhiyong1220@yahoo．com

R736.6;R365

A

1674-9081(2015)03-0191-06

10.3969/j.issn.1674-9081.2015.03.006

2015-02-27)

梁智勇 電話:010-69159369，E-mail:liangzhiyong1220@yahoo．com