劉 青,杜守穎,尼瑪次仁,米 久,次仁旺加
1北京中醫(yī)藥大學,北京 100102;2西藏藏醫(yī)學院
青藏高原不同種紅景天中沒食子酸含量的定量分析*
劉 青1,2,杜守穎1△,尼瑪次仁2,米 久2,次仁旺加2
1北京中醫(yī)藥大學,北京 100102;2西藏藏醫(yī)學院
目的:對青藏高原不同種紅景天中沒食子酸進行分析,建立定量分析方法,為其進一步利用提供依據。方法:采用HPLC法測定沒食子酸的含量,以30%乙醇提取樣品;Shim-pack VP-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm);甲醇-0.04%磷酸溶液(10∶90)為流動相;檢測波長274 nm。結果:線性范圍為1.0μg/mL~200.0μg/mL(R=0.9999),平均回收率為100.49%,RSD為1.8%。結論:該方法簡便,準確,重復性、回收率好,可用于青藏高原不同種紅景天中沒食子酸含量的測定。
紅景天;青藏高原;HPLC;沒食子酸
紅景天屬植物在我國有73種,西藏有32種,2個變種[1],就其青藏高原紅景天而言,享有“高原人參”之美譽。既是珍貴藥用植物,亦是藥食同源植物,近年研究表明,紅景天具有抗缺氧、抗寒冷、抗微波輻射、延緩衰老和抗癌等功效,應用廣泛[2]。紅景天的多種功效與其含有多種活性成分密切相關,2010版《中華人民共和國藥典》中把紅景天苷作為紅景天的檢測指標,隨著研究的深入,發(fā)現沒食子酸在紅景天成分中占有較大比例,同時沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學活性[3];目前主要應用于抗菌抗病毒、抗腫瘤方面,其他行業(yè)也有廣泛應用。本研究采用液相色譜法,以其活性成分沒食子酸為對照,對青藏高原紅景天進行定量分析研究,并對不同產地,不同品種進行比較,為進一步開發(fā)利用及其制劑的質量標準研究奠定基礎和提供依據。
梅特勒A E200電子天平;島津LC-20A液相色譜儀,配S P D-20A紫外可見檢測器;S h im-p a c k VP-OD S色譜柱(250 mm×4.6 mm);P h enomene x G emini OD S色譜柱(250 mm×4.6 mm);W ondaSi l C18(150mm×4.6mm);KQ-250D B超聲清洗器(250W,昆山超聲儀器有限公司)。甲醇(色譜純,F i sh er公司);乙醇(分析純,成都全山化學試劑有限公司);30%乙醇(取乙醇加水自配);磷酸(上海紅衛(wèi)農藥廠);蒸餾水(自制)。沒食子酸(中國食品藥品檢定研究院,批號:110831-201204)。青藏高原不同種紅景天由西藏藏醫(yī)學院組織采集(共20個樣品)。
2.1 色譜條件 S h im-p a c k VP-OD S色譜柱(250mm×4.6mm);流動相:甲醇-0.04%磷酸溶液(10:90);柱溫:25℃;流速:1.0m L/min;檢測波長274 nm。
2.2 供試品溶液制備 取本品粉末約2.5 g,精密稱定,置50m L量瓶中,加30%乙醇20m L,20℃超聲處理(功率250W,頻率40 K H z)20分鐘,靜置室溫,加30%乙醇稀釋至刻度,搖均,精密量取5m L,置25m L量瓶中,加30%乙醇稀釋至刻度,搖均,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品適量,加30%乙醇制成每1 m L中含0.2 m g的溶液,即得。
2.4 系統(tǒng)適應性試驗 取”2.3”項對照品溶液及供試品溶液,照“2.1”項下色譜條件,各進樣20μl,測得H PLC圖譜。理論塔板數按沒食子酸峰計算不低于4000,見圖1。
圖1 高效液相色譜圖
2.5 線性關系的考察 精密配制系列濃度的沒食子酸對照品溶液1.0μg/m L、20.0μg/m L、40.0μg/m L、80.0μg/m L、120.4μg/m L、200.0μg/m L,分別精密進樣20μL,測定峰面積,見表1、圖2。
表1 沒食子酸線性范圍測定結果
圖2 沒食子酸線性范圍測定結果
根據上述試驗結果,沒食子酸濃度與其峰面積之間在1.0~200.0μg/m L范圍內,存在良好的線性關系(R=0.9999)。
2.6 精密度試驗 精密量取沒食子酸對照品溶液10μl(100μg/m L)重復進樣5次,其峰面積測量值,計算其R S D為0.2%。
2.7 穩(wěn)定性試驗 任取樣品(2號樣品)按正文方法制備,分別在0、4、9、13、17、21小時測定,計算其R S D為0.1%,結果表明,樣品溶液在21小時內穩(wěn)定性良好。
2.8 重現性試驗 任取樣品(4號樣品)按正文方法制備,每隔1小時進樣1次,共6次,(R S D=0.5%n=6)。
2.9 回收率試驗 采用加樣回收法,精密稱取適量的已測知含量的紅景天(沒食子酸含量為3.546 m g/g;6號樣品)9份,分為低、中、高三個不同濃度,分別精密加入沒食子酸對照品溶液(1.0m g/g)7.1m L、9.0m L、10.5m L,計算加樣回收率,結果平均回收率為100.49%,R S D=1.8%。
2.10 樣品測定 取上述20個樣品,按”2.1”色譜條件測定,計算其中沒食子酸的含量,見表2。
表2 樣品測定結果
根據相關文獻[4-5],流動相比例為甲醇-0.04%磷酸溶液(10∶90)能保證沒食子酸峰與雜質峰的分離度、理論板數較好;在274 nm處有較高的吸收。對于紅景天中沒食子酸的提取溶劑選擇,比較了甲醇,70%甲醇,50%甲醇,30%甲醇,乙醇,70%乙醇,50%乙醇,30%乙醇,其中同濃度的紅景天藥材中,30%乙醇作為溶劑時沒食子酸的峰面積最大,故以30%乙醇作溶劑進行提取。本研究采用H PLC法對青藏高原不同種紅景天中沒食子酸進行了含量測定,方法精密度好,測定結果準確。從測定結果看,青藏高原不同種紅景天中沒食子酸含量分別為大花紅景天0.29~6.6 m g/g,圣地紅景天0.10~2.9 m g/g,卵萼紅景天1.0~1.6 m g/g,長鞭紅景天0.10 m g/g,狹葉紅景天0.28 m g/g。從采集的20個樣品看,傳統(tǒng)、市場都可以作為紅景天原藥材使用,但就沒食子酸含量差異的原因,主要是品種差異,其生長環(huán)境不同(如沙地、草地、巖石、溪流河畔等),還有采收時間、加工方法、貯藏條件等。
[1] 宋月英,韓慧文,郝素云,等.紅景天研究進展[J].武警醫(yī)學院學報[J],2004,13(1):66-68.
[2] 尼瑪次仁,劉青,多杰仁青,等.青藏高原紅景天研究進展及存在問題[J].中華中醫(yī)藥雜志.2013,28(9):2675-2678.
[3] 李肖玲,崔嵐,祝德秋.沒食子酸生物學作用的研究進展[J].中國藥師,2004,7(10):767-769.
[4] 章娟,段虎成,畢開順.HPLC法同時測定大花紅景天中的4個酚類成分的含量[J].北方藥學,2011,8(7):13-14.
[5] 頓珠,劉青,索朗其美,等.HPLC法測定藏藥余甘子膏中沒食子酸的含量[J].中草藥,2010,41(9):1477-1478.
Quantitative AnalysisofGallic Acid in D ifferent Speciesof HongJingTian in Qinghai-Tibet Plateau
LIU Qing1,2,DU Shouying1△,NIMA Ciren2,MIJiu2,CIRENWangjia2
1 Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China; 2 Tibetan College of Tibetan Medicine
Objective:To provide reference for furtherutilization of gallic acid by analyzing gallic acid in differentspecies of HongJingTian(Rhodiola rosea L.)in Qinghai-Tibet plateau and establishing themethod of quantitative analysis.Methods:The contents of gallic acid were determined by HPLC,the samples were extracted w ith 30% ethanol;Shim-pack VP-ODS chromatographic column(250mm×4.6mm);acetonitrile-0.04%phosphoric acid(10∶90)as themobile phase;detection wavelength was 274 nm.Results:Linear rangewas between 1.0μg/m L and 200.0 μg/m L(R=0.9999),average recovery rateswere100.49%,RSD was1.8%.Conclusion:Themethod,which is simple, accurate,reproducible and good recovery rate,could be used for content determ ination of gallic acid in different speciesof HongJingTian in Qinghai-Tibetplateau.
HongJingTian;Qinghai-Tibetplateau;HPLC;gallic acid
R927.2
A
1004-6852(2015)07-0025-03
2014-10-25
973計劃前期研究專項(編號 2012CB722905)。
劉青(1976—),男,講師,在讀博士研究生。研究方向:中藥(藏藥)新型與技術。
△通訊作者:杜守穎(1960—),女,博士學位,教授,博士研究生導師。研究方向:中藥新劑型與制劑關鍵技術的研究。