楊維杰，康學(xué)東，朱 瑾，余臣祖，王苑銘，安小平，張瀚文

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

解毒化濁方對(duì)胰島素抵抗大鼠GLUT4m RNA表達(dá)的影響*

楊維杰，康學(xué)東△，朱 瑾，余臣祖，王苑銘，安小平，張瀚文

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

目的：探討解毒化濁方對(duì)胰島素抵抗大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)4(glucose transporter 4,GLUT4)表達(dá)的影響及其治療胰島素抵抗的作用機(jī)理。方法：將雄性wistar大鼠48只隨機(jī)選出12只設(shè)為空白組，采用生理鹽水灌胃，其余大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)方法造胰島素抵抗大鼠模型后，隨機(jī)分為模型組、解毒化濁治療組及羅格列酮治療組，每組12只，解毒化濁組以解毒化濁方混懸液2.025g/（kg·d）灌胃，羅格列酮組以羅格列酮混懸液0.36mg/（kg·d）灌胃，模型組與空白對(duì)照組均予等體積生理鹽水灌胃。治療10周后檢測(cè)大鼠空腹血糖（FBG）、糖耐量試驗(yàn)（2 h血糖）［OGTT（2hPG）］、空腹胰島素(FINS)水平，并應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)各組大鼠骨骼肌組織GLUT4 mRNA的水平。結(jié)果：解毒化濁方與羅格列酮均能降低大鼠FBG、2hPG及FINS水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在降低體質(zhì)量方面與空白組比較解毒化濁組及羅格列酮組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；解毒化濁組與羅格列酮組大鼠血清FBG、2hPG、FINS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠GLUT4表達(dá)水平呈低表達(dá)（P＜0.05）；與模型組比較，解毒化濁組與羅格列酮組大鼠GLUT4表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。結(jié)論：解毒化濁方可降低胰島素抵抗大鼠血清FBG、OGTT（2hPG）及FINS水平，增加骨骼肌組織中GLUT4的表達(dá)，提高胰島素敏感性，有改善胰島素抵抗的作用。

胰島素抵抗；解毒化濁方；激酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4

胰島素抵抗（In su l in R e s i s tan c e，I R）是指胰島素作用的靶器官、組織(主要肝臟、骨骼肌、脂肪組織)對(duì)胰島素敏感性降低的一種異常狀態(tài)，即需要高于正常劑量的胰島素才能產(chǎn)生正常的生理效應(yīng)。研究表明，I R是一種重要病理生理變化，不僅是肥胖、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化性心血管疾病、脂質(zhì)代謝異常等的共同危險(xiǎn)因素[1]，而且還與妊娠、腫瘤、感染、應(yīng)激等多種生理或病理有著密切關(guān)系。隨著人民生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，長(zhǎng)期高脂飲食使得肥胖的發(fā)病率增高，而因肥胖引起胰島素抵抗的患病率日趨增高。長(zhǎng)期高脂環(huán)境能損害包括骨骼肌、肝臟和脂肪在內(nèi)的多種胰島素靶器官的胰島素敏感性。因此，高脂飲食已成為誘發(fā)胰島素抵抗(I R)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[2]。近幾年胰島素抵抗的研究已經(jīng)成為國(guó)際學(xué)術(shù)界研究的焦點(diǎn)。因此，本研究擬觀察解毒化濁方對(duì)胰島素抵抗大鼠骨骼肌組織胰島素信號(hào)通路中G L U T4表達(dá)的影響，探討其治療胰島素抵抗的作用機(jī)理，為中醫(yī)藥防治胰島素抵抗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心S P F級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供S P F級(jí)W i s tar大鼠48只［4月齡，體質(zhì)量（200±20）g，雄性］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用證號(hào)：S YX K(甘)2011-0001-0000407；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：S C X K(甘)2011-0001-0001365。予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 普通飼料為S P F級(jí)大鼠普通飼料，由甘肅中醫(yī)學(xué)院S P F動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；高脂飼料配方比例為（豬油10%∶膽固醇2%∶膽酸鹽0.5%∶蔗糖20%∶普通飼料67.5%），由北京科澳協(xié)力飼料有限公司定制；大鼠血清胰島素檢測(cè)試劑盒（R at I N S EL IS A K it，甘肅寶信生物技術(shù)公司提供）；D EPC（天津鼎天生物科技有限公司，Si g ma分裝，批號(hào)：D5758）；S Y B R G reen（瑞士羅氏公司）；R na s e-f ree水（北京百泰克生物科技有限公司）；高純總R N A快速提取試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量PC R試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本T a k ara中國(guó)寶生物工程（大連）有限公司，產(chǎn)品代碼分別為 S D1410、RR036、RR820A；引物合成［大鼠G L U T4基因的特異性引物序列由日本T a k ara中國(guó)寶生物工程（大連）］有限公司設(shè)計(jì)并合成；解毒化濁方藥物組成：黃連、黃柏、雞內(nèi)金、山楂、枳殼、丹參，按一定比例配伍而成，用水提法提取，濃縮、干燥、制粒。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立與分組 將48只雄性W i star大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，即空白組12只、造模組36只，造模組采用高脂飼料喂養(yǎng)4周的方法造模，空白組給予普通飼料，4周后通過測(cè)定大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、糖耐量試驗(yàn)（O G TT）2 h血糖、胰島素敏感性｛ISI：ln[1/(F B G× I N S)]｝[3]將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、解毒化濁組及羅格列酮組，解毒化濁組以解毒化濁方混懸液2.025 g/（k g·d）灌胃；羅格列酮組以羅格列酮混懸液0.36m g/（k g·d）灌胃，模型組與空白組均予等體積的生理鹽水灌胃。每組持續(xù)給藥10周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè) 10w后禁食12 h，空腹稱重；同時(shí)檢測(cè)大鼠尾靜脈空腹血糖（F B G）、O G TT（2 h）血糖；O G TT檢測(cè)結(jié)束后所有大鼠按劑量3 m L/k g用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取血，測(cè)空腹血清胰島素(F I N S)，計(jì)算胰島素敏感性(ISI)；并取一側(cè)后肢骨骼肌，裝入凍存管中，迅速凍存于液氮中，24 h后置于-80℃低溫冰箱保存；之后用R T-PC R技術(shù)檢測(cè)胰島素抵抗大鼠骨骼肌組織G L U T4 m R N A表達(dá)。T ri z ol試劑提取骨骼肌總R N A，行完整性和純度鑒定，并依A260值進(jìn)行定量。引物序列如下：G L U T4上游引物為5′-TT G C A G TG CC T G A G T C TT C TT-3′，下游引物為5′-AT C A C TTT C TG T GGGG C G TT-3′，應(yīng)用C F X96 R eal-T ime PC R擴(kuò)增儀，引物濃度為 20μmol/L，常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PC R體系：5×S Y B R G reen b uf f er10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，25mmol/L d N T P s 0.5μL，2 U/L T a q酶 1.5μL，cD N A模板 5μL，dd H2O32μL。條件：93℃3min，1個(gè)循環(huán)；93℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)，于每循環(huán)延伸反應(yīng)最后時(shí)刻收集熒光信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用S P SS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 空白組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)靈敏，體表皮毛光滑，食欲及尿量均正常，未出現(xiàn)大鼠死亡；造模組大鼠隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程逐漸出現(xiàn)皮毛發(fā)黃，毛色粗糙、失去光澤，活動(dòng)減少，喜臥少動(dòng)，飲水量和尿量均有增加，后期大鼠精神明顯變差，出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，行動(dòng)遲緩，皮毛粗糙明顯，其中2只大鼠死亡，6只大鼠未達(dá)標(biāo)。藥物治療后以上癥狀均有不同程度的好轉(zhuǎn)和改善。其中解毒化濁組有1只大鼠死亡，模型組3只大鼠死亡。

2.2 造模前后各組大鼠體質(zhì)量、FBG、OGTT（2hPG）、ISI水平的變化情況 造模4周后，與空白組相比，造模組大鼠體質(zhì)量、F B G、2h P G水平均有升高，ISI顯著下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明造模成功，見表1。

表1 造模前后各組大鼠體質(zhì)量、FBG、OGTT（2hPG）、ISI水平變化比較

2.3 治療前后各組大鼠體質(zhì)量、FBG、OGTT（2hPG）、FINS水平變化情況 藥物治療10周后，與模型組相比，解毒化濁方與羅格列酮均能降低大鼠F B G、2h P G及F I N S水平，升高ISI，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在降低體質(zhì)量方面與空白組比較解毒化濁組與羅格列酮組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。解毒化濁組與羅格列酮組大鼠血清F B G、2h P G、F I N S比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 治療前后各組大鼠體質(zhì)量、FBG、OGTT（2hPG）、FINS、ISI水平變化比較

2.4 各組大鼠骨骼肌中GLUT4表達(dá)水平的變化情況 與空白組比較，模型組大鼠G L U T4m R N A的表達(dá)水平呈低表達(dá)（P＜0.05）；與模型組比較，解毒化濁組與羅格列酮組大鼠G L U T4m R N A的表達(dá)水平均較模型組顯著增加（P＜0.05）；解毒化濁組與羅格列酮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌中GLUT4mRNA表達(dá)水平變化比較

3 討論

3.1 解毒化濁方的作用 解毒化濁方是從事臨床工作多年，具有豐富治療經(jīng)驗(yàn)的康學(xué)東教授在孫思邈《千金方》的啟發(fā)下，依據(jù)胰島素抵抗患者中肥胖者居多組方而來［4］。治則為化濁去痰，清熱解毒。解毒化濁方為純中藥制劑，為甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，方中黃連、黃柏，味苦、性寒，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效，兩藥善清中、下焦?jié)駸幔蕿榫帯，F(xiàn)代藥理研究證明黃連的主要成分為小檗堿，而小檗堿有降低血清抵抗素，改善胰島素敏感性的作用[5]；黃柏含有小檗堿，研究顯示黃柏提取物(P55A)丁醇提取物能通過激活E R K2及P I3-激酶，促進(jìn)肝糖原合成，調(diào)節(jié)血糖濃度[6]；山楂，味酸甘，性微溫，無毒，歸脾、胃、肝三經(jīng)，具消食化積、行氣散瘀的作用；雞內(nèi)金味甘平，入脾、胃、小腸、膀胱經(jīng)，具有消食健胃、澀精止遺的作用，二藥合用可助黃連、黃柏清熱、解毒、化濁之功，共為臣藥；山楂和雞內(nèi)金均有甘油三酯和減少肝及腸系膜中脂肪堆積的作用[7]；枳殼味苦酸、性微寒，具有行氣、化痰、消積的功效，可消心下痞塞之痰，泄腹中滯寒之氣，推胃中隔宿之食，消腹中連年之積，為佐藥[8]；丹參味苦，微寒，具有活血祛瘀的作用，為使藥。諸藥合用，共奏行氣化痰、健脾消積、化濕祛瘀之功。上述藥物均可降低血糖，調(diào)節(jié)血脂，達(dá)到肥胖患者的胰島素抵抗。

3.2 骨骼肌組織GLUT4的表達(dá)在T2DM中的作用 G L U T4是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(G L U Ts)的成員之一，是一種分子量45-55k D，含509個(gè)氨基酸單一多肽鏈的糖蛋白，基本結(jié)構(gòu)由l2個(gè)跨膜片斷鈦鏈相連[9]。以往認(rèn)為G L U T4主要存在于骨胳肌、心肌及脂肪組織中。最新研究表明，G L U T4還存在于其他組織細(xì)胞中，如初生Balb/c鼠腦組織、馬薄片狀角化細(xì)胞、人和鼠胰島組織細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜細(xì)胞和早期人胎盤合體滋養(yǎng)層，并有可能發(fā)揮著獨(dú)特作用。G L U T4的主要功能是在肌肉和脂肪組織中轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖。在無刺激時(shí)，90%以上的G L U T4分布于細(xì)胞內(nèi)，如微粒體、高爾基復(fù)合體、管型囊等囊泡樣結(jié)構(gòu)中，這些囊泡樣結(jié)構(gòu)稱作G L U T4儲(chǔ)存囊泡（G S V s）。在胰島素刺激或運(yùn)動(dòng)刺激下，脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中的G L U T4會(huì)從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜上，發(fā)揮其轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的生理作用[10]。目前已進(jìn)一步證實(shí)骨骼肌細(xì)胞外膜G L U T4的含量與細(xì)胞最大葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力呈正相關(guān)，葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是骨骼肌細(xì)胞利用葡萄糖的主要限速過程。胰島素刺激的靶組織對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)在胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制中起主導(dǎo)作用。由于G L U T4介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是外周組織葡萄糖利用的限速步驟，因此，有關(guān)G L U T4與胰島素抵抗之間的研究具有重要意義。

本研究依據(jù)該信號(hào)通路在血糖調(diào)節(jié)與代謝環(huán)節(jié)中所起的作用，采用解毒化濁中藥干預(yù)胰島素抵抗大鼠，通過檢測(cè)G L U T4在骨骼肌的表達(dá)，從分子水平驗(yàn)證解毒化濁中藥改善I R、降糖、提高胰島素敏感性的作用。

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Effectsof JieDu HuaZhuo Prescription on the ExpressionsofGLUT 4m RNA of the Ratsw ith Insulin Resistance

YANGWeijie,KANG Xuedong△,ZHU Jin,YU Chenzu,WANG Yuanming,AN Xiaoping,ZHANG Hanwen
University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China

Objective:To explore the impactof JieDu HuaZhuo prescription on the expressionsof glucose transporter4(GLUT4)mRNA of the ratsw ith insulin resistance(IR).Methods:Twelve ratswere chosen from 48maleWistar ones,established as the blank group and accepted intragastric adm inistration of physiological saline,the rest rats were fed w ith high lipid fodder to prepare IR ratmodel and random ly divided into themodel group,the treatment group of JieDu HuaZhuo prescription and the treatmentgroup of rosiglitazone,12 rats each group,the treatmentgroup of JieDu HuaZhuo prescription received the lavageof JieDu HuaZhuo suspension in the concentration of2.025g/（kg·d）and the treatment group of rosiglitazone rosiglitazone suspension in the concentration of 0.36mg/（kg.d），themodel group and blank control group equivalent volumes of physiological saline lavage.To detect the levels of FBG, OGTT(2hPG)and FINS of the rats after treating for ten weeks,andmeasure the levels of GLUT4mRNA in skeletal muscles of the rats by RT-PCR.Results:JieDu HuaZhuo prescription and rosiglitazone could decrease the levels of FBG,2hPG and FINS of the rats,the difference showed statisticalmeaning(P＜0.05),the difference had statistical meaning in reducing body weightw ithin the treatmentgroup of JieDu HuaZhuo prescription(P＜0.05);the difference presented no statisticalmeaning in the levelsof FBG,2hPG and FINSbetween the treatmentgroups(P＞0.05);compared w ith the blank group,the levels of GLUT4 expressions in themodelgroup were low(P＜0.05);compared w ith themodel group,the expressions of GLUT4 in the treatment groups increased significantly(P＜0.05).Conclusion: JieDu HuaZhuo prescription could decrease the levelsof FBG,2hPG and FINSof IR rats,enhanceGLUT4 expressions in the skeletalmuscle and improve insulin sensitivity,therefore,to improve IR.

insulin resistance;JieDu HuaZhuo prescription;glucose transporter4

R587.1

A

1004-6852(2015)07-0008-04

2014-09-02

2012年甘肅省教育廳科研項(xiàng)目計(jì)劃（編號(hào)1206-06）。

楊維杰（1980—），男，碩士學(xué)位，主治醫(yī)師。研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥的中西醫(yī)結(jié)合治療。

△通訊作者：康學(xué)東（1962—），男，主任醫(yī)師。研究方向：內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合診治。