陳 鵬,張凡喜,周玉峰,張 波

(1.解放軍第324醫(yī)院神經(jīng)外科,重慶 400020；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所,重慶 400042)

·論著·

FGFR2功能增強(qiáng)對軟骨內(nèi)成骨作用的機(jī)制研究*

陳 鵬1,張凡喜1,周玉峰1,張 波2△

(1.解放軍第324醫(yī)院神經(jīng)外科,重慶 400020；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所,重慶 400042)

目的 利用模擬人Apert綜合征的FGFR2S252W/+小鼠模型，研究ERK信號通路在成纖維細(xì)胞生長因子受體2(FGFR2)功能持續(xù)增強(qiáng)對軟骨內(nèi)成骨過程的影響。方法 動物繁殖、鑒定后分為FGFR2功能獲得突變型和同窩野生型。于出生后6周獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)及2代BMSCs成軟骨誘導(dǎo)，對ERK信號蛋白檢測，并比較Col2、Col10、OC、OP基因的表達(dá)。加入ERK信號通路阻滯劑PD98059后再次培養(yǎng)觀察相應(yīng)基因的表達(dá)。胚胎骨體外培養(yǎng)技術(shù)比較ERK信號通路在FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)對軟骨內(nèi)成骨過程的影響。結(jié)果 在體外BMSCs成軟骨誘導(dǎo)后觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR2功能突變小鼠BMSCs表達(dá)總ERK蛋白量無明顯變化，但磷酸化增強(qiáng)。FGFR2S252W/+小鼠BMSCs表達(dá)Col2、Col10較野生型弱，但OC、OP基因強(qiáng)于野生型小鼠。加入ERK信號通路阻滯劑PD98059培養(yǎng)后，對Col2、Col10基因影響不大，但OC、OP表達(dá)量增高。并且在胚胎骨體外培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)PD98059治療組能糾正FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)所致軟骨內(nèi)成骨發(fā)育障礙。結(jié)論 ERK信號通路是FGFR2下游影響軟骨內(nèi)成骨的關(guān)鍵通路，特別對軟骨內(nèi)成骨后期成骨過程影響巨大。其信號通路阻滯劑對軟骨內(nèi)成骨發(fā)育障礙有一定救治作用。

成纖維細(xì)胞生長因子受體2；ERK信號通路；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；軟骨內(nèi)成骨；軟骨分化

利用基因敲入(knock in)技術(shù)構(gòu)建模擬人Apert綜合征的FGFR2S252W/+小鼠模型，Apert綜合征由成纖維細(xì)胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor2,FGFR2)的功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變引起，患者表現(xiàn)冠狀縫早閉、體形弱小、四肢短小畸形和指/趾畸形[1]。FGFR2功能增強(qiáng)對膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨過程均有影響[2-4]，在對軟骨內(nèi)成骨過程中，F(xiàn)GFR2可能是通過下游MAPK通路進(jìn)行調(diào)控，本研究主要探討ERK信號通路在FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)對軟骨內(nèi)成骨過程的影響。

1 材料與方法

1.1 動物來源 本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈笥擅绹鴩⑿l(wèi)生研究院(NIH)引入[5]，分別將雄性帶neo基因+突變FGFR2的基因工程小鼠、雄性EII-Cre小鼠與雌性C57BL/6J小鼠(2～4月齡)交配擴(kuò)增，得到的F1代經(jīng)鑒定帶neo基因+突變FGFR2的基因小鼠和EII-Cre小鼠再次交配，EII-Cre啟動子去掉FGFR2-neo-S252W的neo基因，在子代中獲得約1/4數(shù)量的FGFR2S252W/+功能獲得性突變小鼠。小鼠基因型鑒定分為野生和突變(FGFR2S252W/+)兩組。EII-Cre、C57BL/6J小鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有小鼠均為SPF級，在實(shí)驗(yàn)過程中由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 臺式高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司,德國)，電泳儀(Bio-Rad公司,美國)，PCR System 7500(Applied Biosy Stems公司,美國)，PCR儀(香港Gene Amp公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)，超凈工作臺(成都新光生物凈化工程研究所)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司,美國)，顯微鏡(Olympus公司,日本)，Spot內(nèi)置彩色數(shù)碼相機(jī)(Diagnostic Ins truments公司,美國)。主要試劑：蛋白酶K(Roche公司,美國)，地塞米松、TGF-β(Peprotech公司,美國)，ITS(Sigma公司,美國)，Rever Tre Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司,日本)，Trizol(Gibco公司,美國)，Phospho-ERK/ERK抗體(Cell signal technology公司,美國)，ERK阻滯劑PD98059(Selleck公司,美國)，高糖DMEM、低糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(HyClone公司,美國)，PBS液。

1.3 FGFR2S252W/+小鼠基因型的鑒定[6]小鼠剪取手指/腳趾，用含100 mg/L蛋白酶K的組織裂解液56 ℃裂解12 h，提取基因組DNA。用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增：帶neo基因+突變FGFR2小鼠，R2-7R2:5′-TTG ATC CAC TGG ATG TGG GGC-3′,RINA:5′-CCA GAC TGC CTT GGG AAA AGC-3′；EII-Cre小鼠，C1:5′-GCC TGC ATT ACC GGT CGA TGC-3′,C2:5′-CAG GGT GTT ATA AGC AAT CCC-3′；FGFR2S252W/+小鼠，R2I6F1:5′-TAG GTA GTC CAT AAC TCG G-3′,R2-7R2:5′-TTG ATC CAC TGG ATG TGG GGC-3′。PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，根據(jù)條帶對小鼠進(jìn)行區(qū)分(圖1)。

圖1 小鼠基因型鑒定電泳圖

1.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)制備 將6周齡野生型及突變型小鼠脫臼處死后置于75%乙醇浸泡10 min，無菌條件下分離出脛骨、股骨；用剪刀剪去股骨、脛骨兩端，用一次性注射器抽取含有10% 胎牛血清的DMEM(低糖)培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，將骨髓細(xì)胞沖入無菌培養(yǎng)皿中；混勻吹散制成細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞首次換液，以后每2 d換1次，7～8 d后細(xì)胞約90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化4 min后吹打，脫落細(xì)胞以1 000 r/min離心5 min，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。選取生長良好的第2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 BMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化及信號阻斷劑培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好的第2代BMSCs，以5×105/孔接種于6孔板中，用含10% 胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。生長7 d左右，待細(xì)胞生長完全融合，換用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液[含有10%胎牛血清、10 ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF-β)、50 μg/mL抗壞血酸、10-7mol/L地塞米松、50 mg/mL胰島素鐵硒傳遞蛋白(insulin-transferrin-selenium,ITS)]的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，每3 d換液1次。為了解ERK信號通路在軟骨內(nèi)成骨過程中的作用，在軟骨誘導(dǎo)液基礎(chǔ)上加入ERK信號通路阻滯劑PD98059，濃度20 μmol，進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基因表達(dá) 取成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d細(xì)胞，加入1 mL Trizol提取RNA。紫外分光光度計(jì)測定純度及濃度。取總RNA 1 μg，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA置-20 ℃保存。小鼠的引物序列如下，Col2，sense primer,5′-TCT TTG GCT CAC TGG ACT CT-3′,antisense primer,5′-CCC CTC CTG CTG TGA AGT TG-3′；Col10,sense primer,5′-GCA GCA TTA CGA CCC AAG AT-3′,antisense primer,5′-CAT GAT TGC ACT CCC TGA AG-3′；OC,sense primer,5′-TCT GAC AAA GCC TTC ATG TCC-3′,antisense primer,5′-AAA TAG TGA TAC CGT AGA TGC G-3′；OP,sense primer,5′-TGC ACC CAG ATC CTA TAG CC-3′,antisense primer,5′-TGT GGT CAT GGC TTT CAT TG-3′。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每次做3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)基因重復(fù)3次。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。加完樣后上實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀反應(yīng)。

1.7 Western blot檢測 取2代BMSCs，提取總蛋白，制備5%濃縮膠和10%分離膠。每個(gè)孔上樣10 μg蛋白樣品，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，8%脫脂奶粉振蕩封閉2 h。按一抗說明書進(jìn)行稀釋、孵育過夜。進(jìn)行二抗室溫孵育，PVDF條帶浸入ECL化學(xué)發(fā)光液發(fā)光5 min后暗室進(jìn)行曝光、顯影。

1.8 胚胎長骨的體外培養(yǎng) 無菌條件下取胚胎(E16)小鼠脛骨進(jìn)行消化10 min(1 mg/mL dispase溶液)，然后在解剖顯微鏡下進(jìn)行操作，剝離絕大部分軟骨外膜和骨外膜。標(biāo)本置于濾紙上后放在不銹鋼網(wǎng)上面，浸入BGJb培養(yǎng)基的井形培養(yǎng)皿的(BGJb培養(yǎng)基含0.2%牛血清清蛋白、50 μg/mL維生素C、10 mM β-甘油磷酸鈉、2 mmol谷氨酸、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵箱內(nèi)孵育。每組各10個(gè)標(biāo)本，分為3組。即野生型組(加入0.1%DMSO)、突變型組(加入0.1%DMSO)、PD98059治療組(突變型組加入50 μmol PD98059)，每2 d換液。體外培養(yǎng)7 d后收集標(biāo)本并固定，在解剖顯微鏡下測量標(biāo)本總長度(total length，TL)，鈣化組織長度(ossified tissue length，OL)。采用長度增加百分率來表示長度的變化。長度增加百分率=(體外培養(yǎng)7 d的長度-體外培養(yǎng)0 d的長度)÷體外培養(yǎng)0 d的長度×100%。

2 結(jié)果

2.1 FGFR2S252W/+小鼠BMSCs增強(qiáng)ERK信號通路磷酸化程度 對野生及突變FGFR2S252W/+小鼠BMSCs中ERK總蛋白及其磷酸化水平利用Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示突變型FGFR2功能增強(qiáng)點(diǎn)突變后BMSCs中ERK總蛋白量表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而磷酸化水平表達(dá)增強(qiáng)(圖2)。結(jié)果揭示BMSCs軟骨內(nèi)成骨過程中FGFR2可能經(jīng)過ERK信號通路對其調(diào)控。

2.2 PD98059使BMSCs中ERK信號通路磷酸化程度減弱 在BMSCs成軟骨誘導(dǎo)液中加入ERK信號通路阻滯劑PD98059，探索ERK信號通路在FGFR2介導(dǎo)BMSCs軟骨內(nèi)成骨分化的調(diào)控作用。再次運(yùn)用Western blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)，PD98059抑制ERK磷酸化水平，說明抑制ERK信號通路，見圖2。

圖2 Western blot顯示FGFR2S252W/+BMSCs中信號通路變化

2.3 使用PD98059后對BMSCs表達(dá)基因的影響 利用定量PCR方法分別檢測BMSCs成軟骨誘導(dǎo)21 d后成軟骨、成骨分化基因表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)表達(dá)成軟骨分化基因Col2、Col10突變型小鼠BMSCs表達(dá)量低于野生型小鼠(P<0.05)，而反應(yīng)軟骨內(nèi)成骨晚期成骨分化基因OC、OP提示突變型小鼠BMSCs表達(dá)量高于野生型小鼠(P<0.05)。這些結(jié)果顯示FGFR2功能增強(qiáng)對BMSCs軟骨內(nèi)成骨分化過程中早期成軟骨分化是抑制作用，而晚期成骨分化是促進(jìn)作用(圖3)。將BMSCs在加入ERK阻斷劑成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，檢測21 d后相關(guān)基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)PD98059培養(yǎng)后對BMSCs表達(dá)Col2、Col10變化不大，對表達(dá)成骨分化OC、OP基因有所增強(qiáng)(圖3)。

*：P<0.05，與control組BMSCs比較；#：P<0.05，與WT組BMSCs比較。

圖3 通路阻滯劑培養(yǎng)對成軟骨、成骨基因表達(dá)的影響

2.4 體外培養(yǎng)長骨的生長情況 取材胚胎小鼠的脛骨(E16)在體外培養(yǎng)條件下繼續(xù)生長發(fā)育。體外培養(yǎng)7 d觀察，野生型及突變型小鼠脛骨的TL及OL有明顯差異，突變型小鼠骨發(fā)育落后于野生組小鼠，TL、OL均短于野生型小鼠，說明FGFR2增強(qiáng)在體外培養(yǎng)過程中也抑制軟骨內(nèi)成骨過程。而添加PD98059后體外培養(yǎng)突變型小鼠長骨TL及OL明顯增長，較突變型小鼠有明顯差異，說明ERK信號通路阻滯劑PD98059可能對由FGFR2持續(xù)增強(qiáng)介導(dǎo)的軟骨內(nèi)成骨遲緩有救治作用(圖4)。

*：P<0.05，與MT組比較；#：P<0.05，與WT組比較。

圖4 胚胎骨體外培養(yǎng)觀察及長度增長比例比較

3 討論

FGFRs屬于受體酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族，主要有4種受體(FGFR1、2、3、4)，他們通過與成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGFs)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)部分人類遺傳骨骼疾病由FGFR突變引起，說明FGFR對骨骼的生長發(fā)育起著非常重要作用[1,6-8]。

利用基因敲入技術(shù)建立了FGFR2功能獲得性基因突變小鼠模型，其FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)，除了表現(xiàn)顱縫早閉、圓顱畸形外，突變小鼠出現(xiàn)體形弱小、四肢的短縮畸形，這些臨床表現(xiàn)符合Apert綜合征患者臨床表現(xiàn)[9-10]。既往研究發(fā)現(xiàn)在骨骼發(fā)育過程中，F(xiàn)GFR2不僅調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的發(fā)育，在軟骨細(xì)胞同樣檢測到FGFR2[2,11]，說明FGFR2還能夠調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)育，影響軟骨內(nèi)過程。

BMSCs具有取材方便、更新能力強(qiáng)、有多向分化能力等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。而在軟骨內(nèi)成骨過程中，正是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞密集開始，逐漸分化形成軟骨細(xì)胞及軟骨樣骨胚，隨著破骨細(xì)胞侵入、吞噬及其血管延伸形成，軟骨細(xì)胞被成骨細(xì)胞取代，鈣化成骨。本實(shí)驗(yàn)獲得FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究，體外模擬軟骨內(nèi)成骨過程，主要研究下游關(guān)鍵信號通路對FGFR2介導(dǎo)軟骨內(nèi)成骨的影響。

既往研究證實(shí)在骨骼發(fā)育過程中FGFs/FGFRs信號發(fā)揮非常重要的作用，而MAPK作為FGFs/FGFRs信號下游通路在骨骼發(fā)育過程中作用重大，MAPK通路主要由ERK、JNK、p38共3種激酶組成，研究表明ERK信號通路在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的發(fā)育中扮演重要角色[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)FGFR2S252W/+突變BMSCs的ERK磷酸化程度顯著增強(qiáng)，這個(gè)結(jié)果提示FGFR2通過調(diào)控下游ERK通路對軟骨內(nèi)成骨進(jìn)行調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，繼續(xù)通過ERK信號通路阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs中添加ERK通路的阻斷劑PD98059，可見顯著緩解了ERK磷酸化的表達(dá)。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs模擬軟骨內(nèi)成骨過程，進(jìn)一步運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較通路改變后對成軟骨、成骨分化基因的改變。研究發(fā)現(xiàn)突變型BMSCs聯(lián)合ERK通路阻滯劑聯(lián)合培養(yǎng)后，成軟骨基因Col2、Col10變化不大，而成骨相關(guān)基因OC、OP表達(dá)有上調(diào)。結(jié)合軟骨內(nèi)成骨過程，作者考慮FGFR2受體通過下游ERK信號通路在早期成軟骨過程中ERK通路作用影響不大，而在后期成骨過程中通過ERK通路負(fù)性調(diào)節(jié)成骨發(fā)育過程，最終阻礙軟骨成骨過程。既往Miraoui等[12]研究發(fā)現(xiàn)在FGFR2功能增強(qiáng)的間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2中ERK1/2及PKC通路激活調(diào)控成骨增殖、分化過程，對成脂過程影響不大。

作者取胎鼠(E16d)脛骨構(gòu)建體外培養(yǎng)模型，進(jìn)一步驗(yàn)證在軟骨內(nèi)成骨過程中FGFR2S252W/+模型中ERK通路的影響。體外培養(yǎng)模擬長骨發(fā)育過程，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育期間FGFR2S252W/+小鼠其長骨總長度及鈣化長度均短于野生型小鼠，說明FGFR2功能增強(qiáng)導(dǎo)致突變型小鼠軟骨內(nèi)成骨較同窩野生型小鼠遲緩。而經(jīng)體外運(yùn)用ERK信號通路的阻斷劑PD98059(濃度50μmol)聯(lián)合培養(yǎng)后，突變型小鼠長骨發(fā)育障礙得到一定糾正，同之前Yin等[2]報(bào)道在FGFR2S253W/+模型中體外培養(yǎng)顱骨、長骨中加入PD98059延緩顱縫早閉及糾正長骨發(fā)育障礙基本一致。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)FGFR2增強(qiáng)影響下游ERK通路對軟骨內(nèi)成骨過程進(jìn)行調(diào)控，運(yùn)用ERK信號阻滯劑對突變型小鼠軟骨內(nèi)成骨發(fā)育遲緩有一定救治作用。

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The study of the mechanism in the endochondral ossification of bone mesenchymal stem cells in mice by continued enhanced function of fibroblast growth factor type Ⅱ receptor mutation*

ChenPeng1,ZhangFanxi1，ZhouYufeng1，ZhangBo2△

(1.DepartmentofNeurosurgery，PLAHospital324，Chongqing400020,China;2.ResearchInstituteofSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To study the role of ERK signal pathway in the endochondral ossification of bone mesenchymal stem cells,and to explore the mechanism of ERK signal pathway in persistent enhanced FGFR2 function on development of mice BMSCs by a knock-in mouse model with the FGFR2S252W/+.Methods Mice with neo-FGFR2 gain-of-function mutation were mated with EII-Cre mice.The genotype of generation mice were identified by PCR and divided into wild type group and mutant type group according to their genotype.6 week-old mice were sacrificed to receive bone mesenchymal stem cells.The western blot was used to compare the level of P-ERK and ERK and the RT-PCR was applied to detect the genes of Col2,Col10,OC,OP in chondrogenic differentiation medium of BMSCs.Then,treatment of cultured BMSCs with PD98059,compare the changes of genes and utilize the in vitro culture of long bones detect the role of ERK signal pathway in the endochondral ossification by FGFR2 mutant.Results We successfully derive BMSCs from FGFR2S252W/+mutant mice and found the activity of ERK signal pathway of FGFR2S252W/+was enhanced.After been cultured in chondrogenic differentiation medium,the expressions of the BMSCs mRNA of Col2,Col10 from mutant group were decreased,while the expressions of OC,OP were increased.Those OC,OP genes levels showed an increased treated by PD98059.Using in vitro culture of long bones,we found the retardation of total length growth of long bones has been rescued by PD98059 treatment,suggesting that ERK signal pathways was responsible for the retarded long bone development in FGFRS252W/+mice.Conclusion The results indicate these effects are mediated by the ERK signal pathway.Furthermore,the retardation of long bones has been recued by PD98059 treatment,suggesting that ERK signal pathway is responsible for the retarded long bone development in FGFR2S252W/+mice.

FGFR2;ERK signal pathway;bone mesenchymal stem cells;endochondral ossification;chondrogenic differentiation

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.08.001

國家973計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2011CB964701)。 作者簡介：陳鵬(1983-),醫(yī)師，碩士，主要從事臨床神經(jīng)外科研究?！?/p>

，Tel：13527371337；E-mail：zhangbo67184@163.com。

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1671-8348(2015)08-1009-03

2014-10-08

2014-12-10)