劉 君，張麗艷

1遼寧省中醫(yī)藥研究院中藥炮制研究室，遼寧 沈陽(yáng)110034；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

螞蟥藥材的指紋圖譜研究*

劉 君1，張麗艷2

1遼寧省中醫(yī)藥研究院中藥炮制研究室，遼寧 沈陽(yáng)110034；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

目的：研究螞蟥藥材的指紋圖譜。方法：采用SD S-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離螞蟥藥材提取物中的蛋白質(zhì)類成分，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。結(jié)果：電泳圖譜清晰，指紋圖譜共有條帶10條，非共有峰面積＜10%，經(jīng)方法學(xué)考察，RSD%均小于3%。結(jié)論：方法穩(wěn)定，可靠，且重現(xiàn)性良好。

水蛭；螞蟥；指紋圖譜

螞蟥(Whitmania pigra Whitman)，為水蛭科動(dòng)物螞蟥的干燥全體，又叫寬體金錢蛭，是一味經(jīng)典的破血逐瘀藥，其藥性咸、苦、平，有小毒，歸肝經(jīng)。螞蟥具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥之效，臨床用于治療血滯經(jīng)閉，癥瘕積聚，跌打損傷等瘀血阻滯之癥［1］。螞蟥是《中國(guó)藥典》一部(2010版)收載的中藥水蛭的3個(gè)品種之一。螞蟥主產(chǎn)于中國(guó)，在臨床上應(yīng)用廣泛，為水蛭藥用的主流品種［2］。許多研究資料表明，中藥水蛭中主要的活血作用為抗凝血，而其抗凝血的主要成分為多肽及蛋白質(zhì)類［3］。而筆者前期研究結(jié)果表明，螞蟥水溶性成分具有良好的抗凝血作用。本研究采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對(duì)螞蟥藥材提取物中蛋白類成分進(jìn)行有效的分析分離，并進(jìn)行指紋圖譜研究，對(duì)螞蟥藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供研究方法，為其藥材的合理使用及開發(fā)提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 螞蟥藥材 購(gòu)于江蘇沛縣，經(jīng)中國(guó)海洋生物研究所鑒定為螞蟥。本實(shí)驗(yàn)采用干品藥材，系10月份捕捉后洗凈，用沸水燙死，曬干或低溫干燥，備用。

1.2 M H-3對(duì)照品 為從中藥螞蟥中提取出來(lái)的蛋白質(zhì)單體，為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定其相對(duì)分子量約為15580Da。

1.3 試劑 所有試劑皆為分析純。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 指紋圖譜 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。

1.4.2 供試品制備 取螞蟥藥材，粉碎，取粉末1 g，精密稱定，加入蒸餾水50 mL，置勻漿器中勻漿，放置過(guò)夜，冷藏(-4℃)，離心，取上清液定容于100 mL量瓶中備用。

1.4.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取MH-3凍干粉，加重蒸餾水制成每1 mL含100 μg的溶液，備用。

1.4.4 電泳條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 儀器：DYYIII-24A型垂直板凝膠電泳槽；ECP-3000型三恒電泳儀，由北京六一儀器廠提供，Kodak 265變焦數(shù)碼相機(jī)為美國(guó)伊士曼柯達(dá)公司提供GIS-700D凝膠圖象處理系統(tǒng)，由上海天能科技有限公司提供。

1.4.5 測(cè)定方法 精密吸取供試品溶液20 μL，對(duì)照品10 μL分別加入凝膠板加樣孔中，分離膠濃度：12.5%；濃縮膠濃度：5%。電流恒定在16 mA，待指示劑距前沿約1 cm時(shí)，停止電泳，取出，固定，染色，得電泳膠片。用GIS-700D凝膠圖象處理系統(tǒng)測(cè)定各條帶的遷移率及條帶面積，電泳圖譜如下：

圖1 螞蟥藥材的電泳指紋圖譜

圖2 螞蟥藥材電泳指紋圖譜的條帶號(hào)

1.4.6 指紋圖譜 藥材指紋圖譜技術(shù)參數(shù)見表1—2。

表1 螞蟥藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相對(duì)遷移率

表2 螞蟥藥材電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相對(duì)條帶面積

螞蟥藥材指紋圖譜共有條帶10條，供試品指紋圖譜中與參照物MH-3相應(yīng)的條帶為9號(hào)，將其作為內(nèi)標(biāo)物，非共有峰面積＜10%。

1.4.7 方法學(xué)考察

1.4.7.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12小時(shí)內(nèi)按以上方法檢測(cè)，結(jié)果表明，其相對(duì)遷移率RSD%在0.22%～2.96%之間，相對(duì)條帶面積RSD%在0.31%～1.09%之間。說(shuō)明在12小時(shí)內(nèi)測(cè)定，穩(wěn)定性試驗(yàn)良好。

1.4.7.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)5次進(jìn)行測(cè)定，其相對(duì)遷移率RSD%在0.27%～2.02%之間，相對(duì)條帶面積RSD%在0.35%～1.67%之間。結(jié)果表明儀器的精密度試驗(yàn)良好。

1.4.7.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品5份，分別按以上方法測(cè)定，其相對(duì)遷移率RSD%在0.39%～1.89%之間，相對(duì)條帶面積RSD%在0.62%～1.74%之間。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性良好［4］。

1.4.8 藥材測(cè)定 取固定產(chǎn)地(江蘇沛縣)，固定捕捉時(shí)間(10月份)，加工方法固定的10批螞蟥藥材進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定，其相對(duì)遷移率及相對(duì)條帶面積見表3—4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，以本實(shí)驗(yàn)室自行提取的螞蟥中的蛋白質(zhì)單體MH-3作為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)螞蟥藥材進(jìn)行電泳指紋圖譜研究，其圖譜清晰，指紋圖譜共有條帶10條，非共有峰面積＜10%，經(jīng)方法學(xué)考察，RSD%均小于3%，方法穩(wěn)定，可靠，而且重現(xiàn)性良好。

表3 10批藥材指紋圖譜相對(duì)遷移率

表4 10批藥材指紋圖譜相對(duì)條帶面積

對(duì)動(dòng)物藥指紋圖譜的研究是一個(gè)值得關(guān)注的領(lǐng)域，本研究采用蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜技術(shù)，建立螞蟥藥材中蛋白類成分的指紋圖譜，這種方法利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術(shù)，可以將微量的蛋白質(zhì)檢測(cè)出來(lái)，該方法較為簡(jiǎn)單、快速、可靠，而且費(fèi)用較低，為螞蟥藥材的指紋圖譜研究建立了一種新的方法，也為動(dòng)物藥指紋圖譜的研究提供新思路。

［1］ 王蒙萌.水蛭的化學(xué)成分及藥理作用［J］.黑龍江中醫(yī)藥，2008(2)：47-48.

［2］ 瞿新燕.水蛭的抗凝血作用研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，19(13)：1582-1583.

［3］ 李艷玲，趙建平.水蛭化學(xué)成分的分離及分析概述［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11(9)：43-44.

［4］ 袁曉環(huán)，楊旭東，崔榮君，等.水蛭注射液的H PLC指紋圖譜［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39(7)：530-532.

Study on Fingerprint of Leech

LIU Jun1,ZHANG Liyan2
1 Chinese Materia Medica Processing Lab of Liaoning Academy of Chinese Medicine,Shenyang 110034,China;
2 Basic Medical College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To study the fingerprint of leech(Whitmania pigra Whitman).Methods:Albumin ingredients of leech extracts were abstracted by adopting SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),and analyzed by gel imaging processing system.Results:Electrophorogram was clear,there were ten bands in the fingerprints,uncommon peak area＜10%,RSD%was less than 3%after investigated by the methodology.Conclusion: The method is stable,reliable and reproducible.

leech;MaHuang;fingerprint

R284.1

A

1004-6852(2015)10-0040-03

2014-10-27

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào)2006B058)。

劉君(1971—)，女，博士學(xué)位，副研究員。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。