李雷激，劉躍華，高琳，趙沖

凋亡基因Survivin，P53，Bcl-2和Bax在喉癌組織中的表達(dá)及與放療的敏感性

李雷激，劉躍華，高琳，趙沖

（四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川瀘州646000）

目的：檢測(cè)放療前后Survivin、P53、Bcl-2和Bax在喉黏膜上皮組織中的表達(dá)，探討其表達(dá)及與喉癌放療敏感性的關(guān)系。方法：采用免疫組化SP法檢測(cè)Survivin、P53、Bcl-2和Bax在56例單純放療的喉癌患者石蠟標(biāo)本中的表達(dá)，同時(shí)用聲帶息肉正常喉黏膜組織石蠟塊各10例進(jìn)行對(duì)照，對(duì)所有患者進(jìn)行1～5年的隨訪，同時(shí)檢測(cè)放療1年、3年、5年后上述四種癌基因蛋白表達(dá)情況與初次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：Survivin、P53和Bcl-2在聲帶息肉組織中低表達(dá)，而B(niǎo)ax則呈相對(duì)高表達(dá)；Survivin、P53、Bcl-2在喉癌組織中呈高表達(dá)，而B(niǎo)ax則呈相對(duì)低表達(dá)。56例單純放療的喉癌患者中，放療前及放療1年、3年、5年后Survivin檢出率分別是82.1%、67.1%、53.9%、32.8%。分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。P53放療前的表達(dá)率76.7%，放療1年、3年、5年后分別是54.6%、40.1%、26.8%，分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Bcl-2放療前為80.1%，放療1年、3年、5年后分別為65.3%、42.1%、30.9%。分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Bax放療前52.4%，放療1年、3年、5年后分別是49.3%、50.4%、47.7%，分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：Survivin、P53和Bcl-2在喉癌組組織中具有高表達(dá)，對(duì)放療敏感的喉癌患者放療后凋亡抑制基因Survivin、P53和Bcl-2呈現(xiàn)表達(dá)率降低的趨勢(shì)，而B(niǎo)ax呈現(xiàn)表達(dá)率升高的趨勢(shì)，將Survivin、P53、Bcl-2和Bax基因作為判斷喉癌患者放療敏感性的分子指標(biāo)具有一定的臨床運(yùn)用價(jià)值。

喉鱗癌；放療；基因

喉癌作為頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，其治療一直以來(lái)以手術(shù)為主的綜合治療。放療往往廣泛應(yīng)用于術(shù)后補(bǔ)充輔助治療，或因患者年老體弱、腫瘤侵犯范圍過(guò)廣而作姑息治療使用，但于放療而言其優(yōu)勢(shì)在于能最大程度保留患者喉支架的完整性，從而提高患者發(fā)音、進(jìn)食等方面的生活質(zhì)量。但由于個(gè)體差異大，單純放療的療效尚具有不確定性，故如何選擇適合的生物學(xué)指標(biāo)來(lái)對(duì)放療的敏感性進(jìn)行預(yù)判受到研究人員的重視。隨著對(duì)凋亡增殖基因，抑制的研究的深入，目前認(rèn)為Survivin、P53、Bcl-2在喉癌組織中具有高表達(dá)本以得到廣泛認(rèn)可，而B(niǎo)cl-2、Bax之間平衡關(guān)系的失調(diào)誘發(fā)腫瘤的觀點(diǎn)也為研究所接受。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析我院1993年至2010年期間符合納入標(biāo)準(zhǔn)的住院?jiǎn)渭兎暖熀戆┗颊卟v資料56例，年齡42～83歲，其中男55例，女1例，所有病理均經(jīng)病理活檢證實(shí)，其中高分化鱗癌38例，中-低分化18例。聲門(mén)上型8例、聲門(mén)型40例、聲門(mén)下型8例。T1期7例、T2期42例、T3期4例、T4期3例。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。治療方法采用單純CO60照射原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶，劑量60～70 GY，每天2 GY，連續(xù)5 d后休息2 d，全部病例均予以隨訪，隨訪主要通過(guò)門(mén)診復(fù)查，電話及信件隨訪；隨訪石蠟標(biāo)本的取得：以放療后1年、3年、5年仍健在且來(lái)院復(fù)查有原部位再次活檢史，并經(jīng)病理活檢證實(shí)未復(fù)發(fā)的病例。另外選擇同時(shí)期四川醫(yī)科大學(xué)病理科聲帶息肉、正常喉黏膜組織石蠟塊各10例進(jìn)行對(duì)照。

1.2 主要試劑及來(lái)源

即用型人單克隆抗體及檢測(cè)試劑購(gòu)自于武漢博士德公司。

1.3 方法

石蠟標(biāo)本常規(guī)切片，厚度4μM。采用免疫組織化學(xué)SP法，以微波行抗原熱修復(fù)，Survivin、P53使用pH 6.0枸櫞酸緩沖液，微波熱修復(fù)10 min，Bcl-2使用pH 9.0 EDTA修復(fù)液，微波熱修復(fù)15 min，所使用抗體濃度分別為1∶80（Survivin），1∶50（P53）。用已知Bax表達(dá)陽(yáng)性的肝癌組織切片為對(duì)照片，已知Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性的胃癌組織切片為對(duì)照片，Survivin選用乳腺癌組織做陽(yáng)性對(duì)照。P53選用肺癌組織做陽(yáng)性對(duì)照。用磷酸鹽緩沖液代替抗體做陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

采用德國(guó)萊卡病理圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，Survivin、P53、Bcl-2、Bax的陽(yáng)性反應(yīng)定位以胞質(zhì)或胞膜著色呈棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值以x±s表示，使用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 放療療效判定

根據(jù)喉癌患者放療后生存時(shí)間（1、3、5年）來(lái)判定療效對(duì)喉癌的敏感性。

2 結(jié)果

免疫組化染色顯示，Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒，Bc1-2蛋白部分表達(dá)于細(xì)胞核。在高分化的喉癌中，陽(yáng)性細(xì)胞分布在癌巢周?chē)?，同時(shí)中心細(xì)胞及周?chē)?xì)胞染色陰性。在低分化的喉癌中，陽(yáng)性細(xì)胞增加并且分布在整個(gè)癌巢（見(jiàn)圖1、2）。

隨著生存年限的提高(即喉癌放療敏感性的增強(qiáng))，Bcl-2基因表達(dá)逐漸減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．05；而B(niǎo)ax基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0．05；喉癌組織Bc1-2和Bax基因表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0．01，見(jiàn)圖3）。

圖1 Bcl-2染色陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色表達(dá)于高分化鱗癌細(xì)胞胞漿中

圖2 BAX染色陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色表達(dá)于高分化鱗癌細(xì)胞胞漿中

圖3 喉癌放療敏感性與四種基因表達(dá)的關(guān)系

3 討論

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性死亡(programmed cell death，PCD)，是由基因編碼調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)自殺過(guò)程，細(xì)胞凋亡過(guò)程受多基因的精確調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)凋亡通路上的缺陷會(huì)導(dǎo)致各種疾病從神經(jīng)變性到惡性腫瘤。闡明細(xì)胞凋亡途徑的核心機(jī)制有利于提供新的治療腫瘤的方法。治療腫瘤的目的在于使腫瘤細(xì)胞死亡。臨床采用的化療、放療和一些生物療法治療腫瘤，其作用機(jī)制之一就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。治療的一個(gè)新方法是通過(guò)基因和藥理學(xué)方法修復(fù)凋亡蛋白，近來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞中的凋亡或PCD被認(rèn)為是成功治療的基礎(chǔ)。Bcl-2首先被從濾泡狀非霍奇金淋巴瘤患者的14和18號(hào)染色體t(14∶18)易位斷裂點(diǎn)克隆。Bcl-2蛋白是一種跨膜蛋白質(zhì)，不僅存在于B細(xì)胞淋巴瘤中，而且在鱗狀上皮基底層、神經(jīng)組織、唾液腺導(dǎo)管上皮及前列腺等組織中均能檢測(cè)到。Bax和Bcl-2形成異源二聚體，和它自己形成同源二聚體，當(dāng)Bax在細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)時(shí)，凋亡對(duì)死亡信號(hào)反應(yīng)加強(qiáng)，激活死亡，當(dāng)Bcl-2過(guò)度表達(dá)，Bcl-2和Bax形成二聚體，凋亡受到抑制.Bcl-2/Bax的比例作為一個(gè)變阻器決定對(duì)凋亡的敏感性。Survivin表達(dá)不僅與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，而且與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)水平與肺癌的病理演進(jìn)有關(guān)：在從伴輕度不典型增生到伴高度不典型增生或癌的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，其表達(dá)顯著增加。

喉癌的治療一直以來(lái)是以手術(shù)為主的綜合治療，但隨著社會(huì)的發(fā)展，越來(lái)越重視患者術(shù)后的發(fā)音、進(jìn)食等生存質(zhì)量方面的問(wèn)題，對(duì)喉癌患者喉功能的保全成為在最大程度根除腫瘤基礎(chǔ)上首先要考慮的問(wèn)題，放療能最大程度保留喉支架的完整性，從而保全喉的功能，然而喉癌放射治療最大的弊端就是敏感性個(gè)體差異很大，單純放療尚不被廣泛接受。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)理論及其技術(shù)在醫(yī)療研究中的不斷應(yīng)用，證實(shí)放射線能夠引起細(xì)胞凋亡，放療中的理想情況是射線引起腫瘤細(xì)胞的死亡，而正常細(xì)胞不受影響。研究表明：放射線引起的細(xì)胞凋亡可能依賴(lài)于P53基因蛋白的介導(dǎo),受Bcl-2基因蛋白水平調(diào)控，因此，P53基因及Bcl-2基因表達(dá)有可能作為判定腫瘤放射治療療效的參考指標(biāo)[1]。也有學(xué)者認(rèn)為：放射治療后能產(chǎn)生速發(fā)型凋亡的組織，其輻射敏感性相對(duì)較高，許多研究證實(shí)，電離輻射可調(diào)控Bcl-2家族基因表達(dá)，其表達(dá)依賴(lài)于野生型P53的Bcl-2的表達(dá)下調(diào)及Bax的表達(dá)上調(diào)[2～4]。Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)拮抗輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax、Bcl-2高表達(dá)則增強(qiáng)腫瘤輻射敏感性。Bcl-2家族抗凋亡成員如Bcl-2與Bcl-X及促凋亡成員Bax、Survivin、P53等促、抗凋亡蛋白數(shù)量變化可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的反應(yīng)，在一定程度上也反映了腫瘤的輻射敏感性[5]。Survivin、P53及Bcl-2基因表達(dá)在喉癌組織中從無(wú)表達(dá)到強(qiáng)表達(dá)不等，將Survivin、P53及Bcl-2基因表達(dá)強(qiáng)度分為強(qiáng)度表達(dá)、中度表達(dá)及陰性表達(dá)，并探討了每種基因表達(dá)與喉鱗癌放療敏感性的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)放療敏感組Survivin、Bcl-2基因表達(dá)較低，而放療非敏感組Bcl-2基因表達(dá)較高，放療敏感性與Bcl-2基因表達(dá)相關(guān)。而P53基因表達(dá)則相反，放療敏感組Survivin、P53基因表達(dá)較高，放療非敏感組P53基因表達(dá)較低。結(jié)果表明放療敏感性與Survivin、Bcl-2及P53基因表達(dá)具有相關(guān)性，全相關(guān)系數(shù)較低[6-8]。因此顯示Survivin、P53和Bcl-2基因綜合表達(dá)強(qiáng)度與喉癌放療敏感性具有更高的相關(guān)性。當(dāng)然，喉癌放療敏感性是受多種因素影響決定的，如能應(yīng)用這些因素對(duì)喉癌放療敏感性進(jìn)行綜合判定，是預(yù)測(cè)喉癌患者放射治療敏感性及預(yù)后的較好的指標(biāo)。

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（2015-03-20收稿）

我校獲教育部第八屆高校校園文化建設(shè)優(yōu)秀成果獎(jiǎng)

近日，教育部下發(fā)通知，公布了第八屆高校校園文化建設(shè)優(yōu)秀成果評(píng)選獲獎(jiǎng)名單。我校申報(bào)的成果《興崇廉尚潔之風(fēng)建風(fēng)清氣正校園——四川醫(yī)科大學(xué)“清風(fēng)校園”廉政文化建設(shè)活動(dòng)紀(jì)實(shí)》獲得優(yōu)秀獎(jiǎng)。

近年來(lái)，我校堅(jiān)持將廉政文化建設(shè)納入學(xué)校黨風(fēng)廉政建設(shè)和校園文化建設(shè)總體布局，以打造“立德樹(shù)人、風(fēng)清氣正”的校園文化氛圍為目標(biāo)，在全校范圍內(nèi)開(kāi)展“清風(fēng)校園”廉政文化建設(shè)活動(dòng)，不斷加大廉政宣傳教育力度，強(qiáng)化廉政文化陣地建設(shè)，實(shí)施廉政文化精品工程，創(chuàng)新廉政文化載體形式，取得了明顯成績(jī)。

據(jù)悉，全國(guó)高校校園文化建設(shè)優(yōu)秀成果評(píng)選由教育部思政司負(fù)責(zé)組織實(shí)施，是我國(guó)高校校園文化建設(shè)成果的最高獎(jiǎng)項(xiàng)，倍受教育行政部門(mén)和各高校的重視和關(guān)注。本屆“全國(guó)高校校園文化建設(shè)優(yōu)秀成果”，全國(guó)各高校共申報(bào)743項(xiàng)，經(jīng)專(zhuān)家嚴(yán)格評(píng)審和公示，共評(píng)出特等獎(jiǎng)10項(xiàng)，一等獎(jiǎng)30項(xiàng)，二等獎(jiǎng)60項(xiàng)，優(yōu)秀獎(jiǎng)106項(xiàng)。

Relationship between the expression of Survivin，P53，Bcl-2 and Bax，and radiosensitivity in laryngeal carcinoma

Li Leiji，Liu Yuehua，Gao Lin，Zhao Chong
Department of Otolaryngology-HNS，the First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University

Objective:To investigate the expression of Survivin，P53，Bax and Bcl-2 in laryngeal epithelium, and to investigate the relationship between the expression of laryngeal epithelium and the sensitivity to radiotherapy.Methods:The expression of Survivin group，P53，Bcl-2 and Bax expression were detected in 56 cases of laryngeal cancer patients with radiotherapy paraffin specimens,and laryngeal precancerous lesions such as paraffin blocks of leukoplakia of the larynx and vocal cord polyp of normal laryngeal mucosa in 10 cases were compared,combined with the clinical data,1-5 year follow-up of all patients,the recurrence cases again the inspection organization,and detection of the four oncogene protein expression and initial test results and survival analysis was performed.Results:Survivin、P53、Bcl-2 showed low expression in vocal cord polyps,however，Bax showed a relatively high expression.Survivin，P53，Bcl-2 had a high expression in laryngeal carcinoma tissues, while Bax showed relatively low expression Of the 56 patients.Before radiotherapy，the rate is 82.1%,one year after the radiotherapy，three years and five years later,the detection rate of Survivin in laryngeal carcinoma tissues was 67.1%，53.9%and 32.8%，respectively.Statistically significant difference(P＜0.05).The expression rate of P53 before radiotherapy is 76.7%,which is reduced to 54.6%after 1 year,40.1%after 3 years，and 26.8%5 years later which were significantly different(P＜0.05).Bcl-2 before radiotherapy was80.1%,afterradiotherapy is 65.3%,42.1%,30.9%.Bax before radiotherapy is 52.4%,after radiotherapy it was respectively 49.3%,50.4%,47.7%,and there was no significant difference(P＞0.05).The expression of Survivin,P53,and Bcl-2 was positively correlated with the expression of Bax negatively.The positive cell rates of the expression of the four genes were correlated with the sensitivity of radiotherapy.Conclusion:the expression of Survivin,P53 and Bcl-2 in laryngeal cancer tissues with high expression,is sensitive to radiotherapy for laryngeal carcinoma patients with radiotherapy after inhibitor gene of apoptosis,Survivin,P53 and Bcl-2 showed the trend to reduce the rate of expression and Bax showed expression rates are on the rise trend,Survivin,P53,Bcl-2 and Bax gene as to judge the sensitivity of radiotherapy in patients with laryngeal cancer molecular marker has certain clinical application value.

Laryngealcarcinoma；Radiation sensitivtiry；Gene

R767.19

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.04.021

李雷激（1968-），男，副教授，E-mail：lileiji030@163.com