王 宇，柳云恩，劉欣偉，張玉彪，周大鵬，劉憲民，項良碧

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院骨科，遼寧沈陽 110016;2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷實驗室，遼寧沈陽 110016

骨性關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種與年齡相關的退行性病變，其特征性病變是由軟骨細胞功能失調導致的關節(jié)軟骨退變。OA的危險因素包括性別、職業(yè)、吸煙史以及細胞核遺傳背景，如軟骨基質蛋白、聚蛋白多糖酶-2以及緩激肽B2在基因編碼中的突變［1-2］。線粒體在OA的病變中起到一定作用，線粒體 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)對OA的影響可能因人種及環(huán)境因素的差異而不同。本文選取沈陽軍區(qū)總醫(yī)院的187例膝關節(jié)OA患者，對膝關節(jié)OA與mtDNA的相關性進行研究，評估m(xù)tDNA單倍群對OA發(fā)病率的影響及其潛在的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床材料 收集2012年1月至2014年1月就診于我院的187例膝關節(jié)OA患者作為研究組。其中，女性135例，男性52例，年齡43～86歲，平均年齡(61.59±6.28)歲。納入標準:根據(jù)美國風濕協(xié)會(ACR)標準［3］診斷為膝關節(jié) OA，且根據(jù)患者膝關節(jié)影像學檢查，按照Kellgren-Lawrence(K-L)評分［4］OA的病變度為2級或以上者。將研究組按照K-L評分分值分為2級組42例，3級組66例和4級組79例。對照組患者420例，其中女性237例，男性183例，年齡27～84歲，平均年齡(55.32 ±8.98)歲。對照組為尚未達到膝關節(jié)OA診斷標準且無其他已知的退行性病變(包括癌癥、糖尿病和高血壓可能與線粒體突變有關的疾病)患者。相關知情同意書中所有條目均經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.2 mtDNA測序和拷貝數(shù)的測量 采集患者血液樣本并采用十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解法從外周血獲取基因組DNA。本研究設計2組配套引物以增強mtDNA碎片的作用，這些碎片中包含有亞洲人群mtDNA單倍群中具有診斷意義的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。這些引物的測序結果如下:L15975F:5'-CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3'，H794R:5'-AGGCTAAGCGTTTTGAGCT'G-3'，L9967F:5'-TCTCCATCTATTGATGAGGGTCT-3'，H10858R:5'-AATTAGGCTGTGGGTGGTTG-3'。另一引物的測序結果為:299F:GGTGGAAATTTTTTGTTATG，用來測量mt16184～mt16193多聚胞苷酸間隔的序列。聚合酶鏈鎖反應(PCR)擴增儀(北京索來寶生物科技有限公司)。使用步驟:95℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火后57℃延伸30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)，循環(huán)結束72℃延伸4 min。mtDNA與核DNA的比值代表mtDNA拷貝數(shù)的相對量。實時PCR采用Real-Time PCR系統(tǒng)(美國應用生物系統(tǒng)公司);試劑盒為SYBR?Green qPCR Mastermix(日本寶生物公司)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。單倍群或SNPs與OA發(fā)病率的關系采用χ2檢驗，單倍群、性別和年齡對OA的影響采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 年齡和性別對OA發(fā)病率的影響 研究組中女性比例(72.19%)明顯高于對照組中女性比例(56.43%，OR=0.497，95%CI=0.342 ～0.722，P＜0.01)，同時均明顯高于各組中男性。進行Logistic回歸分析并排除年齡的影響后，其結果差異有統(tǒng)計學意義(OR=0.537，95%CI=0.362 ～0.796，P＜0.05)。K-L評分為3級組的年齡分布(平均61.60歲)和K-L評分為4級組的年齡分布(平均63.60歲)差異無統(tǒng)計學意義，且以上2組患者年齡明顯高于K-L評分為2級組中患者年齡(平均56.77歲)，但2級組和3級組患者中年齡差異無統(tǒng)計學意義，2級組和4級組患者中年齡差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。年齡和OA的病變有密切的關系。

2.2 mtDNA單倍群分析 OA患者中單倍群G出現(xiàn)頻率明顯高于對照組(OR=3.084，95%CI=1.055～9.017，P＜0.05)。排除年齡和性別的影響，OA和單倍群仍有明顯相關性(OR=3.834，95%CI=1.139～12.908，P＜0.05)。然而，OA 患者中單倍群R出現(xiàn)頻率明顯低于對照組出現(xiàn)頻率(OR=0.687，95%CI=0.473 ～0.998，P＜0.05)。單倍群R的效應是通過單倍群F1a和單倍群B產生，而亞群B4則屬于單倍群B4的分支。在排除年齡和性別的影響后，僅單倍群B(OR=0.503，95%CI=0.283～0.893，P＜0.05)和亞群 B4(OR=0.483，95%CI=0.245～0.954，P＜0.05)在 OA患者中出現(xiàn)頻率明顯降低。結果顯示，單倍群B和B4是OA的保護因素。未見其他mtDNA單倍群或亞群與OA有相關性。見表1。

表1 mtDNA單倍群對膝關節(jié)OA的影響

2.3 SNPs分析 對OA患者中個體的SNPs進行分析后發(fā)現(xiàn)，SNP位點T16140C和T16217C在OA患者中更少表達，SNP位點T16140C和T16217C決定單倍群B和B4的表達。在Logistic回歸分析中，排除年齡和性別對數(shù)據(jù)的影響，SNP位點T16140C(OR=0.370，95%CI=0.142 ～0.958，P＜0.05)和T16217C(OR=0.493，95%CI=0.249 ～ 0.977，P＜0.05)比較差異有統(tǒng)計學意義。對其他線粒體單核苷酸多態(tài)性(mtSNPs)進行分析，排除年齡和性別的影響，發(fā)現(xiàn)SNP位點T16362C的存在能夠增強OA的發(fā)病率(OR=1.715，95%CI=1.174～2.506，P＜0.05)。見表2。

表2 線粒體DNA SNPs對膝關節(jié)OA的作用

2.4 線粒體DNA單倍群亞群分析 結果顯示，在病情較重的組別(K-L評分分值為4級)，單倍群G的出現(xiàn)頻率明顯增高(OR=10.870，95%CI=1.307～90.909，P＜0.05)。對于單倍群 B(OR=0.812，95%CI=0.304～2.169，P=0.677)和亞群B4(OR=0.880，95%CI=0.277 ～2.801，P=0.829)，2 者比較，差異無統(tǒng)計學意義。此外，雖然單倍群D4及其亞群D4a、單倍群N9及其亞群N9a對OA既非危險因素也非保護因素，但攜帶有單倍群D4或D4a的患者OA病情病變更嚴重，而攜帶有單倍群N9或N9a的患者OA病情病變較輕微。見表3。

表3 mtDNA單倍群對OA患者K-L評分4級組的病變影響

2.5 mtSNPs位點分析 雖然mtDNA SNPs和OA的病情嚴重性之間的聯(lián)系尚不明確，但mtDNA SNP位點T16362C有加重病情的傾向。見表4。

表4 mtSNPs對OA患者K-L評分4級組的病變影響

3 討論

軟骨細胞是軟骨中唯一存在的細胞類型，并且其變性是OA發(fā)生的主要原因之一。最新研究表明，線粒體在OA的病變中起到一定作用［5］。人類線粒體包括超過1 000種蛋白質，其中的13種由mtDNA編碼。mtDNA突變導致的疾病已有諸多報道［6］。mtDNA突變往往發(fā)生在特定的位點，而非漫長的人類進化中，認為其原因是由于線粒體遺傳位點的多樣性［7］。特定的mtDNA單倍群或者單倍型代表著一組SNPs，兩者在遺傳學和統(tǒng)計學上具有相關性。許多獨立的研究表明，mtDNA的遺傳變異性能夠改變線粒體功能，如鈣動力學、呼吸復合體運動與mtDNA的轉錄和翻譯［8-9］。尤其許多病例對照研究表明，mtDNA與許多復雜疾病，如代謝綜合征［10-11］、神經(jīng)退行性疾?。?2-13］、傳染性疾病［14-15］、癌癥［16-17］和衰老［18］等相關。

中國OA的發(fā)病率與歐洲的發(fā)病率相當［19］。在中國，城市老年人口中患有膝關節(jié)OA的患者數(shù)約占總人口的13%，高于農村地區(qū)的患病率［20–21］。最新研究表明，mtDNA單倍群在西班牙裔人群的髖、膝關節(jié)OA發(fā)病率中起到一定作用，但與OA相關的單倍群J僅在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)，而中國人群中mtDNA 單倍群主要為 A、B、CZ、D、M7、M8 和 F，單倍群F和B在中國人群中更常見［22］。

作為最常見的關節(jié)炎，膝OA導致的疼痛及活動受限給患者生活帶來極大不便。患病的危險因素主要來自遺傳和環(huán)境［23］。本研究結果與OA流行病學研究結果一致［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，女性比男性更易患OA。此外，隨著年齡增加，OA的病情愈發(fā)加重，進一步證實OA是一種與年齡相關的退行性疾病。

病例對照研究表明，在西班牙裔人群中，單倍群J對髖關節(jié)OA和膝關節(jié)OA均有保護作用［25］。值得注意的是，單倍體J能夠延緩膝關節(jié)OA病變的進展［26］。然而，mtDNA對OA的影響可能因人種以及環(huán)境因素的差異而不同。本研究表明，單倍群G和mtSNPs位點T16362C增加OA的風險，而單倍群B和mtSNPs位點 T16140C、T16217C能夠降低OA的易感性。

本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有單倍群G的患者其病情病變更為嚴重。由于線粒體突變是與年齡相關的退行性疾病(如OA)發(fā)病的主要原因之一［6］。由此認為OA患者上調了mtDNA的拷貝數(shù)作為線粒體突變的代償性機制。以往研究表明，單倍群G能夠增加mtDNA缺失的發(fā)生率和線粒體活性氧的產生。因此，認為其能夠增加肺癌的風險［27］。而在本研究中，OA患者的外周血(含有單倍群G)中未發(fā)現(xiàn)這種代償機制，這表明其他含有mtDNA單倍群的細胞(如軟骨細胞)由于氧化應激的緣故更容易受到損傷。mtDNA SNP位點16140C對軟骨細胞的保護性作用是通過上調mtDNA拷貝數(shù)來加強線粒體功能，從而免遭氧化應激誘導的損傷以及細胞凋亡。有相關報道認為，mtDNA單倍群B和B4在膽道閉鎖及口腔扁平苔蘚的發(fā)生中作為保護因素［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA單倍群B和B4對OA的發(fā)生具有保護性作用。進一步的線粒體功能性研究證實，單倍體B和B4能夠增加線粒體膜電位和mtDNA拷貝數(shù)，因此降低活性氧的水平和應激下細胞凋亡的數(shù)目，保護軟骨細胞［29］。所有這些交互作用均支持單倍群B和B4對軟骨細胞具有保護作用的觀點。同時，以往的研究和本研究均證實，DNA單倍群B、B4和單倍群J(均為R的分支)對中國人群及西班牙人群分別具有保護作用，但是R的其他分支R9和R11并無類似作用［30］。由此表明，是單倍群R分支各自不同的mtDNA變異而不是來自單倍群R分支共有的mtDNA突變決定單倍群B、B4和單倍群J對OA的保護性作用。

在本研究中，SNP位點T16362C是唯一與單倍群不相關卻能夠增加OA風險的mtSNPs。T16362C與G11778A的聯(lián)合作用分別與波蘭的乳腺癌以及日本老年人的萊伯遺傳性視神經(jīng)病發(fā)生相關［31-32］。雖然目前還沒有進一步的功能性研究涉及T16362C，但是以往研究和本研究認為，T16362C是人類退行性病變的危險因素［33］。為了進一步明確結論，需更大樣本量研究來證實mtDNA單倍群對OA的作用。

本研究認為，單倍體G和T16362C是OA發(fā)生的危險因素，而單倍體B及其次級產物單倍體B4與其診斷性線粒體SNPs位點T16140C、T16217C是OA發(fā)生的保護因素。本研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)在OA患者中調高，mtDNA的遺傳背景通過上調OA患者中mtDNA拷貝數(shù)進而影響OA的發(fā)病率。為了解mtDNA遺傳背景在OA發(fā)生及病變中的作用，仍需進一步研究。

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