許彤，閻慧麗，許挺

山東大學附屬省立醫(yī)院 a.耳鼻喉科；b.內(nèi)分泌科；c.影像科，山東 濟南250021

m icroRNA聯(lián)合PET-CT對頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移的診斷價值

許彤a(chǎn)，閻慧麗b，許挺c

山東大學附屬省立醫(yī)院 a.耳鼻喉科；b.內(nèi)分泌科；c.影像科，山東 濟南250021

目的 探討一種新型microRNA試劑盒聯(lián)合正電子發(fā)射斷層/計算機斷層掃描（PET/CT）對頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移的診斷價值。方法 選取40例行全身PET/CT檢查的頭頸部鱗狀細胞癌術后病例，提取外周血標本，應用包含4種m icroRNAs的試劑盒診斷腫瘤術后轉移，并與病理診斷結果進行比較，分析兩種檢查方法及聯(lián)合檢查的敏感性、特異性及準確性。結果 40例病例中，28例經(jīng)病理診斷為頭頸部鱗狀細胞癌轉移。m icroRNA試劑盒診斷頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移的靈敏度為96.43％，特異度為83.33％，準確度為92.50％；PET/CT診斷的靈敏度為89.29％，特異度為91.67％，準確度為90.00％；兩者聯(lián)合診斷的靈敏度為100％，特異度為83.33％，準確度為95.00％。結論 PET/CT診斷頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移的特異性較m icroRNA試劑盒高，而敏感性不足，m icroRNA試劑盒對PET/CT診斷具有補充作用，兩者聯(lián)合應用是診斷頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移的更為理想的方法。

頭頸部鱗狀細胞癌；正電子發(fā)射斷層/計算機斷層掃描；m icroRNA；腫瘤標志物

頭頸部鱗狀細胞癌（Head and Neck Squamous Cell Cancer，HNSCC）是世界第六大腫瘤，占每年世界范圍內(nèi)650，000新發(fā)癌癥病例的6％[1-5]。頭頸部鱗狀細胞癌患者中，約有30％～50％的病例手術后復發(fā)或轉移[6]，其生存時間與是否轉移密切相關，因此早期發(fā)現(xiàn)復發(fā)和轉移病灶對及時治療意義重大。常規(guī)影像學檢查手段（如B超、CT、MRI等）具有一定的局限性，作為CT和核醫(yī)學分子影像設備的結合，PET/CT檢查可輔助診斷術后轉移，發(fā)現(xiàn)潛在病灶，為更早發(fā)現(xiàn)病灶提供可能，但仍然會出現(xiàn)誤診或漏診；同時，由于PET/CT價格較為昂貴，限制了其臨床應用。而外周血microRNA，因其靈敏度高、穩(wěn)定性好、創(chuàng)傷性小，在腫瘤診斷中的應用也越來越受到關注。本研究選取40例頭頸部鱗狀細胞癌術后病例，行PET/CT檢查的同時，采集外周血，應用自行研發(fā)的microRNA試劑盒檢測，旨在探討microRNA試劑盒聯(lián)合PET/CT在頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2007年1月～2014年2月于山東省立醫(yī)院醫(yī)學影像中心診治的40例頭頸部鱗狀細胞癌患者。其中，男28例，女12例，年齡35～76歲，平均（49.5±8.9）歲。舌鱗狀細胞癌10例，口底鱗狀細胞癌8例，喉鱗狀細胞癌5例，鼻腔鼻竇癌7例，牙齦癌4例，唇癌3例，下咽癌3例。所有患者均于本研究開始前于山東省立醫(yī)院行原發(fā)癌及對應淋巴清掃術，術后時間6～39個月，平均16個月；患者因術后查體、自覺不適、臨床懷疑腫瘤轉移等原因，于山東省立醫(yī)院影像中心行PET/CT檢查。所有病例均在PET/CT檢查前取血清樣本。

1.2 儀器與方法

1.2.1 PET/CT檢查

采用Discovery Lightspeed PET/CT機，囑患者檢查前空腹4～6 h，控制血糖≤7.0 mmol/L，在安靜、避光、平臥狀態(tài)下，以3.7～5.55 MBq（0.10～0.15 mCi）/kg體重注射顯影劑。50～60 min后，采用三維采集及飛行時間（Time of Flight，TOF）采集技術，確定掃描部位，檢查范圍自頭頂至大腿中部，共6～7個床位，每床位3 min，并對CT數(shù)據(jù)進行衰減校正，采用迭代法獲得全身各方位重建的融合圖像。采用半定量方法進行診斷，即最大標準攝取值（SUVmax）＞2.5作為判斷陽性的標準。對初次檢查發(fā)現(xiàn)病變的部位于注射藥物后2 h進行延遲掃描，同時排除正常生理性攝取。

1.2.2 microRNA試劑盒檢查

microRNA試劑盒包含4種microRNA的反轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）引物，分別為：miR155、miR324、miR23a、miR181。引物設計參照文獻，引物合成由上海生工生物技術公司完成。采用mirVana miRNA提取試劑盒（美國Ambio公司），miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（中國天根生化公司），miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（中國天根生化公司），MJMini梯度PCR儀（美國Biorad公司），IQ5 PCR實時熒光定量檢測系統(tǒng)（美國Biorad公司）。

所有患者均于PET/CT檢查前采集靜脈外周血，外周血經(jīng)3000 r/min離心，將分離出的血清置-80 ℃冰箱保存待測，按照miRVana PARIS試劑盒的使用說明書進行血清總RNA的提取。提取的總RNA進行下一步的反轉錄，配制反應體系，充分混勻后進行反轉錄。反應總體積為20μL，反應條件設定為95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；40個循環(huán)。以5S rRNA為內(nèi)參，miRNA的表達量表示為F= 2-ΔΔct，計算公式為：-ΔΔct=ΔctmicroRNA-Δct5SrRNA。以4種miRNA試劑盒檢測結果中有任意不小于三種miRNA表達上調(diào)作為陽性判斷標準。

1.3 臨床診斷方法

所有患者均隨訪3個月，由2位副主任以上醫(yī)師采用雙盲法進行診斷。根據(jù)以下條件診斷腫瘤是否轉移：①再次手術或活檢病理證實腫瘤轉移；②超聲、CT、MRI或后續(xù)PET/CT等影像學檢查發(fā)現(xiàn)新發(fā)病灶或病灶增大；④臨床治療過程及病情發(fā)展。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。以臨床最終診斷為金標準，計算PET/CT、microRNA試劑盒及聯(lián)合檢查診斷頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移的靈敏度、特異度、準確度。計算公式：準確度=（真陽性+真陰性）/（真陽性+假陰性+真陰性+假陽性）×100％；特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100％；靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100％。

2 結果

2.1 臨床診斷結果

40例病例中，28例經(jīng)臨床診斷為腫瘤術后轉移，其中15例經(jīng)組織病理學證實，13例經(jīng)其他影像學檢查及隨訪確診；另12例病例至2014年6月1日未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移。

2.2 PET/CT檢查結果

40例病例中，26例經(jīng)PET/CT檢查為陽性，其中1例結合臨床診斷為不相關炎癥，25例結合臨床診斷為腫瘤轉移（圖1）；14例陰性，其中3例結合臨床診斷為腫瘤轉移，11例至2014年6月1日未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移（表1）。

圖1 PET/CT影像

表1 PET/CT檢查結果

2.3 m icroRNA試劑盒檢查結果

40例病例中，29例經(jīng)microRNA試劑盒檢測為陽性，其中27例結合臨床診斷為腫瘤轉移，2例至2014年6月1日未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移；11例陰性，其中1例結合臨床診斷為腫瘤轉移，10例至2014年6月1日未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移（表2）。

表2 m icroRNA試劑盒檢查結果

2.4 PET/CT聯(lián)合m icroRNA試劑盒檢查結果

兩種方法有一種為陽性時判斷為陽性，同時為陰性時判斷為陰性。28例結合臨床診斷為術后轉移；10例為PET/CT陰性且microRNA試劑盒陰性（表3）。

表3 PET/CT聯(lián)合microRNA試劑盒檢查結果

2.5 統(tǒng)計分析結果

以臨床最終診斷為金標準，應用公式計算得，PET/CT診斷的靈敏度為89.29％，特異度為91.67％，準確度為90.00％；microRNA試劑盒診斷的靈敏度為96.43％，特異度為83.33％，準確度為92.50％；兩者聯(lián)合診斷的靈敏度為100％，特異度為83.33％，準確度為95.00％。

3 討論

PET/CT與傳統(tǒng)CT、MRI等的成像原理不同，它是將解剖成像、葡萄糖代謝及功能顯像融合在一起的分子影像技術，反映組織和病灶區(qū)域糖代謝的差異[7-9]。分析圖像時，解剖及代謝的統(tǒng)一是確診的立足點，但在日常診斷工作中，具有空間分辨率較低等缺點，經(jīng)常會遇到解剖及代謝不統(tǒng)一的情況，給診斷帶來了不確定因素[10-11]。本研究中，以臨床最終診斷為金標準，PET/CT診斷頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移的靈敏度為89.29％，特異度為91.67％，準確度為90.00％，仍存在著假陽性、假陰性的誤判斷。同時，由于PET/CT價格較為昂貴，限制了其臨床應用。

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類全長為19～25個核糖核苷酸的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，由一段具有發(fā)卡環(huán)結構的單鏈RNA前體剪切后生成，通過與目標mRNA分子的3’-端非編碼區(qū)域（3-UTR）互補配對，抑制目標mRNA的翻譯，實現(xiàn)轉錄后水平的表達調(diào)控。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的miRNAs達9500多個，大量研究發(fā)現(xiàn)microRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。同時，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，外周血miRNAs不僅具有穩(wěn)定的物理、化學狀態(tài)，且其在腫瘤患者中的表達量與正常人明顯不同，越來越多的文獻報道其作為一種特異的腫瘤標志物的價值。大量研究證明，外周血miRNAs在前列腺癌、胃癌、肺癌、結直腸癌和乳腺癌等發(fā)生的早期即有明顯的改變。

在頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后等方面，microRNAs同樣起著重要作用，國內(nèi)外學者也做了大量相關研究。2009年Wong等[12]通過qRT-PCR技術分析了4種舌癌，結果發(fā)現(xiàn)早期舌癌患者與進展性舌癌患者血液中的miR-184含量均明顯增高。而手術切除原發(fā)灶后，miR-184含量明顯下降。2010年Liu等[13]報道，口腔鱗癌患者血液中miR-31表達上調(diào)，并且與年齡等因素相關。同時，在手術切除腫瘤后，表達明顯下降。同年，Lin等[14]也發(fā)現(xiàn)，miR-24在口腔鱗癌患者的血液中過表達。2011年，Yang等[15]發(fā)現(xiàn)組織與血液中miR-181的過表達與口腔鱗癌患者淋巴結轉移、不良預后有密切相關性。2012年，Maclellan[16]通過對原位癌等高風險口腔病損患者的血清進行研究，發(fā)現(xiàn)有15種miRNAs明顯上調(diào)，而5種miRNAs（miR-16、let-7b、miR-338-3p、miR-223、miR-29a）明顯下調(diào)。本研究選取4種microRNA（miR-155、miR-324、miR-23a、miR-181）組成試劑盒，分析其在診斷頭頸鱗癌術后轉移中的應用價值。結果表明，其靈敏度為96.43％，特異度為83.33％，準確度為92.50％，較PET/CT更為靈敏，而特異性不足。

本研究將microRNA試劑盒與PET/CT聯(lián)合應用，診斷頭頸部鱗狀細胞癌術后轉移，以任意一項陽性即判斷為轉移，兩項檢查均為陰性判斷為無轉移，特異性雖未提高，但其敏感性、準確度明顯增加，是比較理想的檢查手段，對于指導再次手術或化療、放療后隨訪有重要意義。

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App lication Value of Combination Value of M icro-RNA and PET-CT in Diagnosis of Postoperative M etastasis of Head and Neck Squamous Cell Cancers

XU Tonga, YAN Hui-lib, XU Tingc
a. Departm ent o f O to laryngo logy；b. Department of Endocrinology；c. Department of Imaging, Shandong Prov incia l Hosp ita l A ffiliated to Shandong University, Jinan Shandong 250021, China

Ob jective To discuss the application value of positron em ission tomography/computed tomography（PET/CT）and m icro-RNA in diagnosis of post-operative metastasis of head and neck squamous cell cancers. Methods A ltogether 40 patients w ith surgical history of head and neck cancer simultaneously underwent the examination of PET/CT in combination w ith a micro-RNA kit that was comprised four micro-RNAs. The results were compared w ith the final diagnosis so as to analyze the sensitivity, specificity and accuracy of these two diagnosis methods. Results Of those 40 cases, 28 were found w ith metastases of head and neck squamous cell carcinoma as was diagnosed pathologically. The sensitivity, specifi city and accuracy of the m icro-RNA kit for diagnosis of metastasis were 96.43％, 83.33％ and 92.50％. While, those of PET/CT were 89.29％, 91.67％ and 90.00％, respectively. Promisingly, those by the detection of PET/CT combined w ith the micro-RNA kit were 100％, 83.33％ and 95.00％. Conc lusion PET/CT showed higher specificity and lower sensitivity in assessment of postoperative metastasis of head and neck cancers than those by the m icro-RNA kit. The m icro-RNA kit detection may be used as a supplementary tool to PET/CT exam ination. Combined use of the two exam inations was an ideal strategy for detecting the metastases of head and neck cancers.

head and neck squamous cell cancer；positron em ission tomography/computed tomography；micro-RNA；tumor markers

R739.91；R814.42

B

10.3969/j.issn.1674-1633.2015.10.014

1674-1633（2015）10-0051-04

2015-03-02

2015-04-02

山東省科技發(fā)展計劃（2014GSF1181）。

許挺，主管護師。

通訊作者郵箱：d594251@163．com