韓 煦，景 曄，陸光生，喬 賽，唐瑩瑩，白 虹

（1.天津醫(yī)科大學(xué)；2.中國(guó)人民解放軍第464醫(yī)院，天津300381）

血清食物不耐受特異性IgG檢測(cè)方法的研究

韓 煦1，景 曄2，陸光生2，喬 賽1，唐瑩瑩1，白 虹1

（1.天津醫(yī)科大學(xué)；2.中國(guó)人民解放軍第464醫(yī)院，天津300381）

目的 建立生物素－鏈霉親和素間接包被方法檢測(cè)疑似牛奶食物不耐受患者血清特異性IgG抗體。方法將鏈霉親和素包被反應(yīng)板，牛奶的三個(gè)組分：酪蛋白、β－乳球蛋白、α－乳白蛋白標(biāo)記生物素，并以3∶3∶1的比例混合，加入抗體及酶標(biāo)抗人IgG，檢測(cè)繪制特異性IgG定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而建立生物素－鏈霉親和素抗原間接包被檢測(cè)法檢測(cè)牛奶特異性IgG抗體。并以美國(guó)Biomercia酶聯(lián)免疫法作為參比方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果 本文建立的生物素－鏈霉親和素間接包被法檢測(cè)牛奶特異性抗體的批間精密度為7.0%－9.5%；批內(nèi)精密度為4.6%－8.7%。與參比方法對(duì)比，靈敏度為92.1%，特異度為90.0%。結(jié)論 本方法可用于檢測(cè)牛奶特異性IgG抗體，用于牛奶制品引起的食物不耐受的體外診斷。

食物不耐受；特異性IgG；生物素－鏈霉親和素

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0951）

食物不耐受是區(qū)別于食物過(guò)敏的另一種變態(tài)反應(yīng)疾病，機(jī)體的免疫系統(tǒng)針對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的不耐受食物產(chǎn)生食物特異性IgG抗體，食物中的不耐受原與抗體IgG結(jié)合，從而形成的免疫復(fù)合物導(dǎo)致機(jī)體各系統(tǒng)發(fā)生不同程度的反應(yīng)［1］，發(fā)病率為20%－45%［2，3］。因此檢測(cè)特異性IgG對(duì)食物不耐受的診斷有重要的意義，而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法通常采用的都是直接包被模式，檢測(cè)過(guò)敏原組分固定，但是不同患者間存在個(gè)體差異，因此為了克服傳統(tǒng)直接包被模式，本研究以牛奶特異性IgG為例，創(chuàng)新采用生物素－鏈霉素親和素間接包被模式，檢測(cè)特異性抗體，并與現(xiàn)有方法進(jìn)行對(duì)比，探討其特異性和敏感性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo scientific公司）；96孔酶標(biāo)反應(yīng)板為美國(guó)康寧公司。

1.1.2 試劑 活化生物素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；生物素化牛血清蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鏈霉親和素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗人抗體購(gòu)自Southern Biotech公司；牛血清白蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；食物特異性IgG抗體檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Biomerica公司；酪蛋白、β－乳球蛋白、α－乳白蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 血清標(biāo)本 血清標(biāo)本均來(lái)自天津市中研院附屬醫(yī)院和天津市人民醫(yī)院進(jìn)行食物不耐受的常規(guī)標(biāo)本，檢測(cè)試劑為美國(guó)Biomerica公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫法試劑盒。牛奶不耐受陽(yáng)性血清共38例，男性18例，女性20例，平均年齡（22.4±6.2）歲；陰性血清40例，男性22例，女性18例，平均年齡（24.4± 5.6）歲，對(duì)照組經(jīng)詢問(wèn)無(wú)過(guò)敏史，另選擇常見食物sIgG檢測(cè)陰性，選擇牛奶中等強(qiáng)度陽(yáng)性以上的標(biāo)本混合作為陽(yáng)性混合血清，選擇牛奶陰性的標(biāo)本混合作為陰性混合血清。

1.2 方法

1.2.1 選擇不耐受原 選用牛奶作為研究對(duì)象，牛奶成分中主要不耐受原為酪蛋白、β－乳球蛋白、α－乳白蛋白，分別用生物素標(biāo)記，按3∶3∶1比例混合。

1.2.2 制備生物素標(biāo)記過(guò)敏原 在0.1mol／L碳酸氫鈉溶液（pH 9.5）中分別加入待偶聯(lián)的三種牛奶蛋白，配制成濃度為1mg／ml溶液；將20mg／ml活化的生物素溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中；按照生物素與牛奶蛋白20∶1的比例，逐滴地加入生物素到攪拌中的牛奶溶液中，室溫下持續(xù)攪拌1h；在4℃下用0.1mol／L的PBS溶液（pH 7.4）透析24 h，期間數(shù)次換液，使游離的未結(jié)合的生物素充分去除，分裝貯存，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 制備酶標(biāo)反應(yīng)板 取聚苯乙烯微孔板，用包被緩沖液作1∶3 000稀釋生物素化血清白蛋白（濃度為10mg／ml），每孔150μl，室溫過(guò)夜。250μl洗滌兩次，每次10min。微孔板甩干后再加入工作濃度為1∶4 000的鏈霉親和素，每孔150μl，室溫靜置2h。棄除包被溶液，再洗滌2次。微孔板甩干后再加入封閉緩沖液（2%牛血清白蛋白），每孔250 μl，4℃，16－18h。棄封閉液，真空干燥、包裝備用。

1.2.4 制備人IgG標(biāo)準(zhǔn)品 用含1%小牛血清的0.1mol／LPBS（pH 7.4）溶液將純品IgG配成5個(gè)不同的濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為“0U／ml”、“50U／ml”、“100U／ml”、“200U／ml”、“400 U／ml”，標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)國(guó)際質(zhì)控血清校準(zhǔn)。

1.2.5 制備質(zhì)控血清 分別選擇10例牛奶中等陽(yáng)性（100－200U／ml）血清混合配制陽(yáng)性質(zhì)控血清；同時(shí)選擇10例正常對(duì)照（小于50U／ml）血清混合配制陰性質(zhì)控血清。

1.2.6 建立生物素化牛血清白蛋白－鏈霉親和素酶聯(lián)免疫法 在之前制備的酶標(biāo)反應(yīng)板中，每孔加入25μl待測(cè)血清（用0.1mol／Ml PBS 1∶20倍稀釋），然后加入混合后的生物素抗原100μl，混勻，置37℃水浴60min；洗板5次后拍干；加入125μl酶標(biāo)抗體，37℃水浴30min，洗板5次后拍干；加入顯色液A、B，各50μl／孔；室溫、避光條件下反應(yīng)15 min；各孔再加入終止液50μl；充分混勻后讀取A450nm。以棋盤滴定法即用不同濃度的生物素抗原選擇酶標(biāo)抗體最佳稀釋度。

1.2.7 建立特異IgG定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 首先用上述建立的方法在最優(yōu)條件下測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的A450nm，橫坐標(biāo)（X）為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)（Y）為相應(yīng)濃度的A450nm，采用四參數(shù)擬合方式繪制劑量－反應(yīng)曲線。

1.2.8 方法學(xué)評(píng)價(jià) 分別取牛奶弱陽(yáng)性和中等陽(yáng)性混合血清，同批或分批測(cè)定10次，考察批間精密度和批內(nèi)精密度。分別取其他食物不耐受的陽(yáng)性血清，測(cè)定方法的特異性。

以美國(guó)Biomerica公司生產(chǎn)的食物過(guò)敏原特異性IgG酶聯(lián)免疫法試劑作為參照試劑，將同一標(biāo)本分別用進(jìn)口試劑和本方法同時(shí)測(cè)定，觀察檢測(cè)結(jié)果一致性。

2 結(jié)果

2.1 生物素標(biāo)記牛奶過(guò)敏原棋盤滴定結(jié)果 將混合生物素標(biāo)記牛奶蛋白分別稀釋成1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG稀釋度采用1∶12 000，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 生物素標(biāo)記牛奶蛋白濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

表1顯示，生物素標(biāo)記牛奶蛋白稀釋度為1∶3 000時(shí)，本底吸光度值為0.062，混合陰性血清0.217；A陽(yáng)性／A稀釋液為8.97、A陽(yáng)性／為A陰性為2.56。本實(shí)驗(yàn)選擇1∶3 000作為生物素標(biāo)記牛奶蛋白的最佳稀釋度。

2.2 特異性IgG定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別以不同濃度（“0U／ml”、“50U／ml”、“100U／ml”、“200U／ml”、“400U／ml”）IgG標(biāo)準(zhǔn)血清為橫坐標(biāo)，吸光度（A450nm）為縱坐標(biāo)，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合方式，酶標(biāo)記抗－人IgG稀釋度為1∶12 000，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 血清IgG定量劑量－反應(yīng)曲線

2.3 精密度測(cè)定結(jié)果 分別選取陰性血清、牛奶陽(yáng)性血清、強(qiáng)陽(yáng)性血清，分別進(jìn)行批內(nèi)測(cè)定和批間測(cè)定，各測(cè)定10次，獲得酶聯(lián)免疫法測(cè)定特異性IgG的批內(nèi)、批間精密度，如表2所示。

表2 牛奶特異性IgG精密度測(cè)試結(jié)果

2.4 特異性測(cè)定結(jié)果 分別選取其他食物（蝦、蟹、豆類、羊肉）等不耐受患者血清，應(yīng)用間接包被模式測(cè)定牛奶特異IgG，分別計(jì)算與這些物質(zhì)交叉反應(yīng)率（牛奶IgG／交叉物質(zhì)IgG）。結(jié)果顯示：測(cè)定牛奶特異性IgG時(shí)，與蝦、蟹、豆類、羊肉等特異性IgG無(wú)交叉反應(yīng)（交叉反應(yīng)率低于0.5%）。

2.5 與參比試劑比對(duì)結(jié)果 以美國(guó)Biomerica酶聯(lián)免疫（間接法）作為參比方法，間接包被酶聯(lián)免疫法分別測(cè)定牛奶特異性IgG。牛奶特異性IgG測(cè)定結(jié)果：敏感度為92.1%（35／38），特異度為90.0%（36／40），準(zhǔn)確度為91.0%（71／78）；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.7%（35／39），陰性預(yù)測(cè)值為92.3%（36／39）。結(jié)果見表3。

表3 間接包被法與參比方法檢測(cè)結(jié)果

3 討論

食物不耐受仍是一個(gè)發(fā)病機(jī)制尚不是很明確的綜合性疾病，可以表現(xiàn)為全身各系統(tǒng)如：皮膚、骨關(guān)節(jié)、呼吸以及消化等各方面的癥狀，并且由于它的發(fā)病有時(shí)會(huì)在進(jìn)食后的數(shù)天，所以臨床上很難做出快速的診斷。食物不耐受的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是口服激發(fā)試驗(yàn)中的雙盲安慰劑對(duì)照食物激發(fā)試驗(yàn)［4］，但是這種方法卻有著高昂的檢測(cè)費(fèi)用，繁雜的操作方法等缺點(diǎn)。目前，多數(shù)通過(guò)ELISA方法測(cè)定患者血清中特異性IgG的濃度，對(duì)食物不耐受進(jìn)行體外診［5，6］。同時(shí)可以判斷出引起患者疾病的食物，指導(dǎo)后期治療。

傳統(tǒng)上檢測(cè)特異IgG抗體采用的是將過(guò)敏原直接包被模式的酶聯(lián)免疫吸附法，然而不同患者間存在明顯的個(gè)體差異，每位患者的檢測(cè)需求不盡相同，食物不耐受檢測(cè)組合需要個(gè)性化，這就和廠家提供的項(xiàng)目組合沖突，造成多余的檢測(cè)或漏檢，增加檢測(cè)成本。而且也不適用于已經(jīng)確定過(guò)敏原患者，經(jīng)脫敏治療后對(duì)單一組分的動(dòng)態(tài)跟蹤監(jiān)測(cè)。為了克服這個(gè)不足，本文采用生物素－鏈霉親和素間接包被模式，對(duì)酶標(biāo)反應(yīng)板的包被制作環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)，建立一種牛奶特異性IgG定量新型檢測(cè)方法。

生物素－鏈霉親和素系統(tǒng)比一般的ELISA更具敏感度，有的甚至高出1000多倍［7］，并且生物素和鏈霉親和素的親和力較高，結(jié)合后形成的復(fù)合物非常穩(wěn)定，而非特異性結(jié)合少。并且這樣的包被模式可以使抗體被包被的空間位阻最大程度的降低，從而到達(dá)抗體利用率被提升，試驗(yàn)成本卻減少的效果［8］。現(xiàn)在多種檢測(cè)指標(biāo)都使用此包被法，如妊娠相關(guān)蛋白A，特異性γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等［9－11］，都取得較好檢測(cè)效果。因?yàn)榕Ｄ滩荒褪芑颊甙l(fā)病較為常見［12］，奶制品又是日常生活較為普遍食物，牛奶中蛋白種類繁多，但是主要以酪蛋白、α－乳白蛋白、β－乳球蛋白為主［13］，因此本文以這三種蛋白為例，建立生物素牛血清白蛋白－鏈霉生物素－生物素化抗原間接包被模式，測(cè)血清中的特異性IgG。研究結(jié)果表明本方法有較高的特異性和精密度。

使用美國(guó)Biomerica公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫法試劑盒作為參比方法，研究結(jié)果表明，本法具有較好的敏感性、特異度、準(zhǔn)確度以及陰、陽(yáng)性預(yù)告值。而且相對(duì)于參比方法來(lái)講，本法可以隨意組合檢測(cè)過(guò)敏原，讓臨床在了解患者病史后，有選擇的檢測(cè)過(guò)敏原，從而滿足不同患者的需求，有效減低患者的檢測(cè)費(fèi)用。

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Study of serum food intolerance specific IgG detection Method

HAN Xu1，JING Ye2，LU Guang－sheng2，et al.（1.Tianjin Medical University；2.The Chinese People＇s Liberation Army464 Hospital，Tianjing300381，China）

Objective To establish a new method that is Biotin－Avsdin System ELISA for the concentration of food intolerance specific IgG（sIgG），taking milk sIgG detection for the example.Methods The microtiter plates were coated with streptavidin.Then，casein，β－lactoglobulin，α－lactalbumin marked biotin which mixedby 3：3：1and specimen were succseeively added into the the wells of plate.After washing，enzyme labeled anti－h(huán)uman IgG was added to establish an antigen indirectly coated liquid－phase rection patterns of ELISA method.Drawing specific IgG quantitative standard detection curve.America Biomercia ELISA method as a reference method to evaluate.Results The method of Biotinstreptavidin indirectly coated to detect sIgG of inter batch precision is 7%－9.5%；intra assay precision ranged from 4.6%to 8.7%.Compared with the reference comparison method，the sensitivity was 92.1%，specificity was 90%.Conclusion The detection method can be used to detect serum sIgG for milk intolerance patients.

food intolerance；specific IgG；milk；biotin－streptavidin

R392

A

2014－08－09）

1007－4287（2015）06－0951－04