曹冉華，云 升，蘇烏云，劉彩霞，趙海燕

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010050）

MCM5在膀胱腫瘤組織和尿脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

曹冉華，云 升，蘇烏云，劉彩霞，趙海燕

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010050）

目的 探討微小染色體維持蛋白（MCM）在膀胱腫瘤組織和尿脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義。方法 收集本院2012年8月—2013年8月住院患者及健康志愿者的尿脫落細(xì)胞或膀胱組織標(biāo)本，對其進(jìn)行MCM5檢測。結(jié)果①膀胱癌患者在不同病理分級、臨床分期MCM／β－actin的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②80例膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞中有71例MCM5呈陽性表達(dá)，與正常對照組和其他泌尿系疾病組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞MCM5陽性率在各病理分級、臨床分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），但其表達(dá)在各病理分級、臨床分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。③與尿細(xì)胞學(xué)相比，尿脫落細(xì)胞MCM5檢測診斷膀胱癌的靈敏度、陰性預(yù)測值較高，假陰性率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），二者的特異度、假陽性率及陽性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 尿脫落細(xì)胞中MCM5檢測對膀胱癌診斷意義重大，是對膀胱腫瘤復(fù)發(fā)檢測、預(yù)后評價(jià)較好的指標(biāo)，值得廣泛應(yīng)用于臨床診斷。

MCM5；膀胱腫瘤；尿脫落細(xì)胞；診斷

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0927）

膀胱腫瘤是最常見的泌尿系腫瘤，其惡性程度強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高，且預(yù)后差，嚴(yán)重地影響患者的生活質(zhì)量，甚至威脅著患者的生命安全。對膀胱腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷是防治本病的關(guān)鍵［1］。許多研究發(fā)現(xiàn)，微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCM）可作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于疾病檢測，為此，我們對MCM5在膀胱腫瘤組織和尿脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義進(jìn)行探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

尿脫落細(xì)胞和膀胱組織標(biāo)本采自我院2012年8月—2013年8月住院的經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為膀胱移行細(xì)胞癌患者80例（膀胱癌組），男性48例，女性32例，年齡28－76歲；病理分級：G1 35例，G2 24例，G3 21例；臨床分期：Tis－T1 34例，T2－T4 46例；其他泌尿系統(tǒng)疾病患者50例（泌尿系疾病組），男28例，女22例，年齡17－79歲；疾病類型包括尿路感染13例，泌尿系結(jié)石15例，輸尿管狹窄16例，前列腺增生6例；隨機(jī)選取20例健康志愿者作為對照組，男12例，女8例，年齡20－75歲。

1.2 標(biāo)本收集及處理

取術(shù)前清晨第2次尿液至少150ml，從中分出1份50ml行尿細(xì)胞學(xué)檢查，剩余尿液做總RNA提取，置于4℃環(huán)境下，1 000r／min離心10min后棄上清液，將沉淀物用生理鹽水清洗2遍后立即提取。80例膀胱癌患者均留存腫瘤組織標(biāo)本，并及時(shí)置于－80℃冰箱內(nèi)保存。

1.3 試劑

選用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑，美國Promega公司生產(chǎn)的TaqDNA聚合酶、dNTPs、Reverse Transcription System試劑盒，北京博大科技公司生產(chǎn)的DNA片段玻璃奶回收試劑盒，上海博亞公司合成的Mcn5、β－actin引物。

1.4 檢測方法

1.4.1 MCM5的檢測 ①提取總RNA：將適量組織置于組織研磨器內(nèi)，放入1ml Trizol試劑，研磨完全后將其轉(zhuǎn)至1.5ml EP管內(nèi)；取所獲得的尿脫落細(xì)胞，放入1ml Trizol試劑，快速抽提并溶于由DEPC處理的雙蒸水內(nèi)，置于－80℃冰箱內(nèi)保存。②Nested RT－PCR：將1μg總RNA加入50μl反應(yīng)體系中。過程如下：逆轉(zhuǎn)錄45℃，45min，90℃，5 min后，變性，94℃，30s后退火，56℃，50s后延伸，94℃，30s后結(jié)束（循環(huán)35次），作為第1次PCR。選擇首次PCR產(chǎn)物1μl，內(nèi)引物5’－CAGGGATGAACTCAAGCGGC－3’和5’－CAGGCTACGAATGCTGGAAG－3’各1μl，按照上述過程進(jìn)行第2次PCR。所生成產(chǎn)物按照20g／L瓊脂糖進(jìn)行電泳，將β－action作為參照物，在同時(shí)有MCM5及β－actin目的片段時(shí)認(rèn)為MCM5陽性，在只出現(xiàn)β－actin目的片段時(shí)認(rèn)為陰性。采用英國Syngene公司生產(chǎn)的GENE GENUS凝膠圖像分析儀做凝膠圖像攝取及灰度值掃描。MCM5相對表達(dá)量采用MCM5／β－actin灰度值比表示。

1.4.2 尿細(xì)胞學(xué)檢查 利用HE染色，將脫落細(xì)胞懸液100μl置入涂片離心器內(nèi)，500r／min離心1 min后涂片，略干燥后浸入高濃度酒精固定20min，行蘇木素染色后用流動水清洗，然后0.5%氨水藍(lán)化約30s，流動水清洗后置0.5%伊紅水30s，流動水清洗后浸入二甲苯，用中性樹脂封固讀片。將檢查結(jié)果中的中度核異質(zhì)、重度核異質(zhì)及腫瘤細(xì)胞認(rèn)為陽性，通過分析靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等評價(jià)檢測尿脫落細(xì)胞MCM5診斷膀胱癌的意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料比較采用方差檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織標(biāo)本中MCM5表達(dá)與臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系

膀胱癌患者在不同病理分級、臨床分期的MCM5表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 膀胱癌組織標(biāo)本中MCM5表達(dá)與臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系

2.2 尿脫落細(xì)胞MCM5表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

80例膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞中有71例MCM5呈陽性表達(dá)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞MCM5陽性率在各病理分級與臨床分期上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），但其表達(dá)量在各病理分級與臨床分期上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表2。

表2 尿脫落細(xì)胞MCM5表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 尿脫落細(xì)胞MCM5檢測及尿細(xì)胞學(xué)診斷膀胱癌的效果

尿細(xì)胞學(xué)檢測膀胱癌患者中有36例陽性。與尿細(xì)胞學(xué)MCM5檢測比較，尿脫落細(xì)胞MCM5檢測診斷膀胱癌的靈敏度、陰性預(yù)測值較高，假陰性率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），二者在特異度、假陽性率及陽性預(yù)測值方面比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 尿脫落細(xì)胞MCM5檢測與尿細(xì)胞學(xué)診斷膀胱癌的效果比較 （%）

3 討論

MCM蛋白家族是由6個(gè)亞單位組成的親水的六聚體復(fù)合物，其mRNA水平隨著細(xì)胞周期而呈周期性變化，于G1后期表達(dá)最高，G0期表達(dá)最低，其中的MCM5是蛋白家族中具有代表性的亞單位之一。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MCM5不出現(xiàn)于終末分化細(xì)胞及靜止細(xì)胞，只表達(dá)于增殖細(xì)胞中，被認(rèn)為是特異性增殖相關(guān)因子［2－4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，MCM5在不典型增生及腫瘤組織中可擴(kuò)展至上皮全層，而在正常組織中僅表達(dá)于上皮基底層的增殖區(qū)，基于此，通過檢測MCM5蛋白表達(dá)即可對是否有腫瘤細(xì)胞做出診斷［5－7］。

本研究中，80例膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞中有71例MCM5呈陽性表達(dá)，且膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞MCM5陽性率隨著病理分級及臨床分期的增加而升高，與既往研究結(jié)果一致。之所以能夠通過對尿脫落細(xì)胞MCM5檢測對膀胱腫瘤做出診斷，主要原因在于膀胱腫瘤細(xì)胞屬于典型的增殖細(xì)胞，不同于正常膀胱表層黏膜細(xì)胞所處的靜止期狀態(tài)，膀胱腫瘤細(xì)胞在增殖期可形成突入膀胱腔內(nèi)的乳頭，而容易在尿液沖刷下脫落。正如前文所述，MCM5存在于不典型增生及腫瘤組織，故可通過對尿脫落細(xì)胞MCM5檢測做出膀胱腫瘤的診斷及預(yù)后評估［8－10］。在利用凝膠圖像半定量對結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，MCM5表達(dá)量在各病理分級、臨床分期上有顯著差異，表明通過檢測尿脫落細(xì)胞中的MCM5有助于判斷膀胱癌腫瘤的惡性程度。

另外，本研究通過RT－PCR方法檢測尿脫落細(xì)胞MCM5診斷膀胱腫瘤的敏感度為88.75%，顯著高于尿細(xì)胞學(xué)檢查的45.00%，但特異度、假陽性率和陽性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究結(jié)果類似。表明尿脫落細(xì)胞MCM5檢測在診斷膀胱癌方面靈敏度及特異度均較高，相比尿細(xì)胞學(xué)檢查具有較大的優(yōu)勢［11］。

綜上所述，尿脫落細(xì)胞中MCM5檢測對膀胱癌診斷意義較大，是對膀胱腫瘤復(fù)發(fā)檢測、預(yù)后評價(jià)較好的指標(biāo)，值得廣泛應(yīng)用于臨床診斷。

［1］寧金卓，姜書傳.卡介苗聯(lián)合藥物較卡介苗灌注預(yù)防膀胱腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)效果的系統(tǒng)評價(jià)［J］.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（1）：52.

［2］朱娟娟.膀胱癌相關(guān)因子研究進(jìn)展［J］.中國腫瘤臨床，2013，40（12）：741.

［3］Goodison S，Rosser C J，Urquidi V.Bladder cancer detection and monitoring：assessment of urine－and blood－based marker tests［J］.Molecular diagnosis ＆therapy，2013，17（2）：71.

［4］曾健文，莫鑒鋒，胡國洪，等.膀胱癌組織中微小染色體維持蛋白2的表達(dá)變化及其意義［J］.山東醫(yī)藥，2012，51（46）：42.

［5］栗東海，劉 明.存活素，微小染色體維持蛋白2在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中華乳腺病雜志（電子版）ISTIC，2013，7（4）：43.

［6］Kelly J D，Dudderidge T J，Wollenschlaeger A，et al.Bladder cancer diagnosis and identification of clinically significant disease by combined urinary detection of Mcm5and nuclear matrix protein 22［J］.PloS one，2012，7（7）：e40305.

［7］Yang G，Zhang L，Lin S，et al.AEG－1is associated with tumor progression in nonmuscle－invasive bladder cancer［J］.Med Oncol，2014，31（6）：986.

［8］Brems－Eskildsen A S，Zieger K，Toldbod H，et al.Prediction and diagnosis of bladder cancer recurrence based on urinary content of hTERT，SENP1，PPP1CA，and MCM5transcripts［J］.BMC cancer，2010，10（1）：646.

［9］Proctor I，Stoeber K，Williams G H.Biomarkers in bladder cancer［J］.Histopathology，2010，57（1）：1.

［10］Hsu I，Vitkus S，Da J，et al.Role of oestrogen receptors in bladder cancer development［J］.Nature Reviews Urology，2013，10（6）：317.

［11］Giaginis C，Giagini A，Tsourouflis G，et al.MCM－2and MCM－5 expression in gastric adenocarcinoma：clinical significance and comparison with Ki－67proliferative marker［J］.Digestive diseases and sciences，2011，56（3）：777.

Detection of mini chromosome maintenance 5 protein in bladder carcinoma tissue and urine exfoliate cells

CAO Ran－h(huán)ua，YUN Sheng，SU Wu－yun，et al.（The First Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot，Inner Mongolia 010050，China）

Objective To explore the expression and clinical significance of tiny chromosome maintenance protein（MCM）in bladder cancer tissue and urine exfoliated cells.Methods Urinary exfoliated cells or tissues of the bladder of hospitalized patients and healthy volunteers in our hospital from August 2012－August 2013were collected，and the urine exfoliated cells or tumor tissue MCM5was tested.Results ①The difference was statistically significant of clinical stagebladder cancer patients in different pathological grading MCM／β－actin（P＜0.05）.②There were 71cases with MCM5positive in 80bladder cancer patients with urinary exfoliated cells，differences between bladder cancer group and Normal control group or other urinary diseases group were statistically significant（P＜0.05）.③compared to urine cytology，sensitivity and negative predictive value of urine exfoliated cells MCM5detection and diagnosis of bladder cancer was significantly higher，false－negative rate was significantly lower，the difference was statistically significant（P＜0.05），There was no statistical significance difference in specific degree，false positive rate and positive predictive value（P＞0.05）.Conclusion Diagnosis of MCM5in urine exfoliated cells to detect bladder cancer have a greater sense，it is a recurrence of bladder cancer detection，prognosis better indicator，it is worth widely used in clinical diagnosis.

MCM5；Bladder tumor；Urine exfoliated cells；diagnosis

R737.14

A

曹冉華（1980－），女，碩士，主治醫(yī)師，從事實(shí)體瘤化療方面的研究。

2014－04－19）

1007－4287（2015）06－0927－03