韋 博，宮賢惠，尹艷春，隋 源，郝繼龍，劉婉瑤，王 樂＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林長春130033；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院白內(nèi)障科，浙江溫州325000；3.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科，吉林長春130021）

Espin WH結(jié)構(gòu)域抑制whirlin全長與espin M結(jié)構(gòu)域在體外細(xì)胞相互作用

韋 博1▲，宮賢惠2▲，尹艷春3，隋 源3，郝繼龍4，劉婉瑤3，王 樂4＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林長春130033；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院白內(nèi)障科，浙江溫州325000；3.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科，吉林長春130021）

目的 具體研究Espin的結(jié)構(gòu)域與whirlin全長在體外細(xì)胞的相互作用。方法 通過免疫共沉淀方法進(jìn)一步研究Espin的多個(gè)結(jié)構(gòu)域與whirlin全長在體外細(xì)胞的相互作用。結(jié)果 在HEK293細(xì)胞中，Espin－A結(jié)構(gòu)域、espin－P結(jié)構(gòu)域與whirlin全長相互作用，espin M、espin WH結(jié)構(gòu)域沒有和whirlin全長存在相互作用。結(jié)論 Espin WH結(jié)構(gòu)域抑制whirlin全長與espin M結(jié)構(gòu)域在體外細(xì)胞相互作用。

Usher綜合征II型；espin

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0886）

Usher綜合征（USH）是一種常染色體隱性遺傳病，在全世界范圍內(nèi)發(fā)生率為1／23000［1－3］。占失明和耳聾疾病的50%，先天性耳聾的5%和視網(wǎng)膜色素變性的18%。在歐洲，USH1，USH2和USH3通常占所有USH患者比例分別為25%－44%，56%－75%，2%［1］，以耳聾和眼盲這兩方面為特征。在臨床上根據(jù)聽力和前庭癥狀的嚴(yán)重程度，USH可分為三種類型［4，5］，I型（USH1）患者嚴(yán)重的先天性耳聾以及嚴(yán)重前庭功能障礙；USH2患者表現(xiàn)為先天性中等度的聽力受損和正常前庭功能；USH3患者表現(xiàn)為循序漸進(jìn)的聽力損害和偶爾的前庭功能障礙。以上三種類型的視力障礙主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素變性［1，6－8］，早期表現(xiàn)為夜盲，外周視力下降和最終中心視力下降。USH是導(dǎo)致失明和耳聾為特征的最普遍的基因疾病。Usher綜合征II型的特點(diǎn)是從出生開始循序漸進(jìn)的聽力損失，視力喪失通常在青春期或成人期。聽力損失也從輕微到嚴(yán)重，主要影響高音調(diào)。

以往研究Usher綜合征II型證明espin＿A結(jié)構(gòu)域、espin＿P結(jié)構(gòu)域、espin＿M(jìn)結(jié)構(gòu)域和whirlin全長共定位，下面我們具體研究下在HEK293細(xì)胞中，Espin A結(jié)構(gòu)域、espin P結(jié)構(gòu)域、espin M結(jié)構(gòu)域、espin WH結(jié)構(gòu)域與whirlin全長相互作用，進(jìn)一步探索USH綜合征的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、恒溫水箱、低溫離心機(jī)、超聲振蕩器、PVDF膜、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

DMEM培養(yǎng)液中加入8%胎牛血清，于37℃恒溫箱培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%后，用LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）將目的質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，即：將0.5μg的兩種目的質(zhì)粒加入30μl的DMEM培養(yǎng)液中，再加入LipofectamineTM2000 2μl，室溫放置10min，均勻加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃恒溫箱孵育10h，觀察熒光蛋白表達(dá)。

1.2.2 體外細(xì)胞免疫共沉淀和western blotting

收集熒光蛋白表達(dá)成功的HEK293細(xì)胞，加入裂解液并進(jìn)行裂解。離心后于上清液中加入蛋白G繼續(xù)緩慢搖晃1h。離心棄沉淀、上清液中加入whirlin抗體搖晃孵育3.5h，離心20 000g 8min。得到的上清液中加入蛋白G sepharose，緩慢搖晃1 h。慢速離心2 000g 10s后，用裂解液洗沉淀物三次，收集洗滌液用Laemmli buffer煮沸10min。所有的操作過程均在0℃條件下進(jìn)行。

取適量細(xì)胞裂解液和洗滌液用SDS－PAGE膠分離提純并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。含有10%脫脂牛奶里孵育1h，來源于兔GFP抗體4℃孵育4h，二抗室溫孵育1h，顯色劑顯色觀察最終蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 Espin的四個(gè)結(jié)構(gòu)域

Espin的四個(gè)結(jié)構(gòu)域如圖1所示。橙色代表EspinA，有八個(gè)并列相連重復(fù)氨基酸序列組成；深藍(lán)色代表espinP，主要含有脯氨酸；綠色代表espin－WH，主要是和威斯科特奧爾德里奇綜合征同源蛋白結(jié)構(gòu)域，紅色代表espinM，主要是促進(jìn)actin肌束形成。

圖1 espin結(jié)構(gòu)域示意圖

2.2 Espin WH結(jié)構(gòu)域抑制whirlin全長與espin M結(jié)構(gòu)域在體外細(xì)胞相互作用

從以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，espin＿A片段、espin＿P片段、espin＿M(jìn)片段和whirlin全長共定位，而espinWH片段則沒有和whirlin全長共定位。從免疫共沉淀的western結(jié)果來看，在whirlin的沉淀物中有espin A和espin P條帶，而沒有espin M和espinWH條帶，說明espin A和espin P和whirlin存在相互作用，而espin M和espinWH和whirlin沒有相互作用。值得注意的是：在espin M和whirlin雙轉(zhuǎn)染的細(xì)胞里，也可見espin M和whirlin共定位。這個(gè)結(jié)果提示我們espin M可能受上游調(diào)控和whirlin相互作用。由于espin WH片段不與whirlin共定位也不存在相互作用，所以espin WH可能是抑制espin M和whirlin的相互作用。

3 討論

EspinA可以結(jié)合myosinIIIa，并進(jìn)行物質(zhì)交換，從內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛的基底部轉(zhuǎn)運(yùn)espin到靜纖毛的尖端。因此，whirlin和espinA在靜纖毛基底部之間的相互作用可以調(diào)控espin轉(zhuǎn)運(yùn)。Espin P除了結(jié)合whirlin外，espin P還結(jié)合IRSp53和profilin［9］，共同參與espin與whirlin的相互作用。值得一提的是，Eps8既與whirlin相互作用［10］，又與IRSp53相結(jié)合［11］。最終在小鼠體內(nèi)whirlin，espinP，Eps8和IRSp53形成一個(gè)蛋白復(fù)合體，在espin基因敲除的小鼠內(nèi)，內(nèi)耳毛細(xì)胞的myosin Xva蛋白位置會(huì)發(fā)生變化［12］。

視網(wǎng)膜感光細(xì)胞分為外節(jié)、內(nèi)節(jié)和連接纖毛三部分，感光細(xì)胞外節(jié)主要負(fù)責(zé)光信號(hào)傳導(dǎo)，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞外節(jié)和內(nèi)節(jié)之間通過一個(gè)狹長的連接纖毛相連。連接纖毛的旁邊有一對中心體，EspinWH結(jié)構(gòu)域就是調(diào)控神經(jīng)元的中心體產(chǎn)生形成肌動(dòng)蛋白束［13］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，espinWH是抑制whirlin和espinM之間作用，阻止espinM結(jié)合肌動(dòng)蛋白單體形成肌動(dòng)蛋白束。

［1］Hartong DT，Berson EL，Dryja TP.Retinitis pigmentosa［J］.Lancet，2006，368（9549）：1795

［2］Boughman JA，Vernon M，Shaver KA.Usher syndrome：definition and estimate of prevalence from two high－risk populations［J］.Chronic Dis，1983，36（8）：595

［3］Keats BJ，Corey DP.The usher syndromes.［J］Am J Med Genet，1999，89（3）：158.

［4］Smith RJ，Berlin CI，Hejtmancik JF，et al.Clinical diagnosis of the Usher syndromes.Usher Syndrome Consortium［J］.Am J Med Genet，1994，50（1）：32.

［5］Petit C.Usher syndrome：from genetics to pathogenesis［J］.Annu Rev Genomics Hum Genet，2001，2（1）：271.

［6］Malm E，Ponjavic V，Moller C，et al.Andreasson：Alteration of rod and cone functionin children with Usher syndrome［J］.Eur J Ophthalmol，2011，21（1）：30.

［7］Sandberg MA，Rosner B，Weigel－DiFranco C，et al.Disease course in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa due to the USH2Agene［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49（12）：5532.

［8］Fishman GA，Bozbeyoglu S，Massof RW，et al.Natural course of visual field loss in patients with Type 2Usher syndrome［J］.Reti－na，2007，27（5）：601.

［9］Sekerkova G，Zheng L，Loomis PA，et al.Espins are multifunctional actin cytoskeletal regulatory proteins in the microvilli of chemosensory and mechanosensory cells［J］.Neurosci，2004，24（23）：5445.

［10］Manor U，Disanza A，Grati M，et al.Regulation of stereocilia length by myosin XVa and whirlin depends on the actin－regulatory protein Eps8［J］.Curr Biol，2011，21（2）：167.

［11］Disanza A，Mantoani S，Hertzog M，et al.Regulation of cell shape by Cdc42is mediated by the synergic actin－bundling activ－ity of the Eps8－IRSp53complex［J］.Nat Cell Biol，2006，8（12）：1337.

［12］Rzadzinska A，Schneider M，Noben－Trauth K，et al.Balanced levels of Espin are critical for stereociliary growth and length maintenance［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2005，62（3）：157.

［13］Loomis PA，Kelly AE，Zheng L，et al.Targeted wildtype and jerker espins reveal a novel，WH2－domain－dependent way to make actin bundles in cells［J］.J Cell Sci，2006，119（8）：1655.

Espin WH domain inhibit the association between espin ABM domain and whirlin

WEI Bo，GONG Xian－h(huán)ui，YIN Yanchun，et al.（China－Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun130033，China）

Objective Studing the association between Multiple regions of espin and whirlin in vitro.Methods Transfecting espin＿A domain，espin＿P domain，espin＿WH，espin＿M(jìn) domain and whirlin－F in HEK293cell，use whirlin antibody immunoprecipitate target protein.Results Identifying espin＿A domain，espin＿P domain interact with whirlin－F.But espin＿WH domain and espin＿M(jìn) domain did not.Conclusion Espin WH domain inhibit the association between espin ABM domain and whirlin.

USH2；whirlin；espin

R774

A

2014－07－09）

1007－4287（2015）06－0886－03

國家自然青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81400404）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（20140520034JH）；吉林大學(xué)白求恩青年科研基金項(xiàng)目（2013205030）

＊通訊作者，▲共同第一作者