王 璇，吳成吉，董淑欣，王志群

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)四科，黑龍江佳木斯154000）

阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長(zhǎng)因子－1和Caspase－3蛋白表達(dá)的情況觀察

王 璇，吳成吉，董淑欣，王志群＊

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)四科，黑龍江佳木斯154000）

目的 觀察阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長(zhǎng)因子－1和caspase－3蛋白表達(dá)情況。方法 90只體重范圍在（240±10g）的健康Wister大鼠，隨機(jī)分為三組：觀察組（β—淀粉蛋白建模大鼠）、對(duì)照組（生理鹽水對(duì)照）和正常組，每組30只。用放射免疫法測(cè)定各組大鼠腦組織中的胰島素樣生長(zhǎng)因子－1（IGF－1），western blot法檢測(cè)各組Caspase－3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 觀察組、對(duì)照組和正常組腦組織中IGF－1蛋白表達(dá)水平分別為［（0.87±0.14）μIU／ml、（2.59±0.27）μIU／ml、（2.67±0.24）μIU／ml］，對(duì)照組、正常組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與觀察組相比差異顯著（P＜0.05）；觀察組、對(duì)照組和正常組大鼠腦組織中caspase－3蛋白表達(dá)水平分別為［（69.72±11.39）μIU／ml，（31.22± 6.98）μIU／ml，（32.53±7.26）μIU／ml］，對(duì)照組和正常組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與觀察組相比具有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論阿爾茨海默病模型大鼠腦組織中的IGF－1蛋白表達(dá)減少，Caspase－3蛋白表達(dá)增加；IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達(dá)在阿爾茨海默病大鼠中呈負(fù)相關(guān)。

阿爾茨海默??；Aβ1－40；IGF－1；caspase－3

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0874）

阿爾茨海默病是一種以大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，神經(jīng)元細(xì)胞突觸損傷或消失，神經(jīng)組織中異常的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)為特點(diǎn)，造成患者進(jìn)行性認(rèn)知障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病［1］。Bassil研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨、海默病的發(fā)生與Aβ的異常堆積密切相關(guān)，細(xì)胞周期相關(guān)細(xì)胞因子異常表達(dá)，引起神經(jīng)元的損傷和丟失，導(dǎo)致患者的認(rèn)知功能進(jìn)行性減退［2］。本次實(shí)驗(yàn)著重研究阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長(zhǎng)因子－1和Caspase－3蛋白的表達(dá)情況，以從分子水平研究阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供的90只體重范圍在（240±10g）日齡45d的正常的Wister大鼠，隨機(jī)分為3組，每組30只，分別為觀察組、對(duì)照組和正常組。

1.2 方法

1.2.1 建模方法［3］無菌條件下，各組大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉。觀察組海馬內(nèi)注射凝聚態(tài)Aβ1－40 4μl，針頭停留3min后緩慢撤針，封閉進(jìn)針口防止溶液彌出，縫合傷口并局部使用抗生素防止感染；對(duì)照組向海馬內(nèi)緩緩注入4μl生理鹽水，其他操作均與觀察組相同；正常組大鼠不做任何處理。各組大鼠均在正常條件下培養(yǎng)。

1.2.2 評(píng)價(jià)認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力［5］Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種通過檢測(cè)大鼠的空間感和方向感來評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)。水迷宮根據(jù)東南西北分為1，2，3，4四個(gè)象限，安全平臺(tái)隨機(jī)固定于某一象限的某個(gè)位置，水面超過安全平臺(tái)1cm，水溫在20－22℃范圍內(nèi)，一共實(shí)驗(yàn)5天。每天分別將大鼠從四個(gè)不同入水點(diǎn)面對(duì)池壁置入水中，記錄其找到安全平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）。若其在2min內(nèi)找不到安全平臺(tái)，則人為牽引至安全平臺(tái)，在平臺(tái)上停留20s再放回籠中，此時(shí)潛伏期計(jì)作120s。取平均值。水迷宮實(shí)驗(yàn)5d后進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是通過檢測(cè)大鼠對(duì)電擊的反應(yīng)來評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)。將大鼠置入反應(yīng)箱中5min熟悉環(huán)境后接通電擊電源，大鼠正常情況下會(huì)條件反射的尋找安全跳臺(tái)以躲避電擊。通過記錄大鼠首次跳上安全跳臺(tái)的時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間）和在5min內(nèi)從跳臺(tái)上錯(cuò)誤跳下的次數(shù)（基礎(chǔ)錯(cuò)誤次數(shù)）；24h后重復(fù)操作，記錄第一次跳下跳臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）和5min內(nèi)錯(cuò)誤跳下的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)）作為評(píng)級(jí)其學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 造模成功后，正常培養(yǎng)各組大鼠5天，在無菌條件下將各組小鼠斷頭取腦，一部分腦組織制成腦勻漿，用免放法檢測(cè)腦勻漿中IGF－1蛋白表達(dá)情況；另一部分腦組織在RIPA蛋白裂解液中提取總蛋白，用免疫印跡法檢測(cè)Caspase－3蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.5軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)量資料用t檢驗(yàn)；并進(jìn)行線性相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的行為學(xué)改變 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察組、對(duì)照組和正常組的潛伏期分別為39.89 s、11.06s、10.23s；觀察組的潛伏期明顯長(zhǎng)于正常組和對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）；正常組和鹽水組的差別較小，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察組較正常組和對(duì)照組相比，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，基礎(chǔ)錯(cuò)誤次數(shù)增多，潛伏期短，錯(cuò)誤次數(shù)多，有顯著差異；正常組和鹽水組的差別較小，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 IGF－1蛋白表達(dá)結(jié)果 觀察組、對(duì)照組和正常組的IGF－1蛋白表達(dá)水平分別為（0.87±0.14）μIU／L、（2.67±0.24）μIU／L、（2.59±0.27）μIU／L。觀察組與正常組和對(duì)照組相比，腦勻漿中的IGF－1蛋白表達(dá)水平明顯減少，差異顯著（P＜0.01）；正常組和鹽水組相比，差異較?。≒＞0.05）。

2.3 Caspase－3蛋白表達(dá)結(jié)果 觀察組、對(duì)照組和正常組中Caspase－3蛋白表達(dá)水平分別為（69.72± 11.39）μg／ml、（31.22±6.98）μg／ml、（32.53± 7.26）μg／ml。觀察組與正常組和對(duì)照組組相比，腦組織中Caspase－3蛋白表達(dá)明顯增多，差異顯著（P＜0.01）；正常組和鹽水組相比，差異較?。≒＞0.05）。

2.4 IGF－1蛋白表達(dá)和Caspase－3蛋白的相關(guān)性利用Spearman相關(guān)性分析對(duì)IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.52，P＜0.01）。

3 討論

阿爾茨海默病是一種常見于老年人的，以大腦皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)異常的老年斑，神經(jīng)突觸的破壞，神經(jīng)原纖維的纏結(jié)，神經(jīng)元的壞死和丟失為特點(diǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病造成患者的進(jìn)行性認(rèn)知障礙，學(xué)習(xí)能力和記憶能力下降。然而阿爾茨海默病的發(fā)生機(jī)制并不十分明確，普遍接受的觀點(diǎn)認(rèn)為其可能與凋亡性細(xì)胞因子的過度活化有關(guān)。研究表明，阿爾茨海默病的發(fā)病主要與神經(jīng)元當(dāng)中的β－淀粉蛋白的異常表達(dá)有關(guān)，促進(jìn)凋亡性細(xì)胞周期相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷和死亡［6］。本次實(shí)驗(yàn)通過觀察β－淀粉蛋白誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠模型腦組織中的IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白的表達(dá)的變化，有助于揭示阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制，有利于尋找臨床治療阿爾茨海默病的有效方法。

β－淀粉蛋白有神經(jīng)毒性，其在神經(jīng)組織中的異常堆積可以造成以影響神經(jīng)突觸延長(zhǎng)，減少神經(jīng)細(xì)胞間的成網(wǎng)，神經(jīng)細(xì)胞遷移能減弱為特征的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，Chommanart的研究表明，β－淀粉蛋白誘導(dǎo)的大鼠模型可以較好的模擬阿爾茨海默病的發(fā)病過程［7］。因此本次實(shí)驗(yàn)使用的造模方法產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)阿爾茨海默病有較好的還原性。

IGF－1蛋白是一種調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化，神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝，突觸的延長(zhǎng)，神經(jīng)組織的修復(fù)，廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的許多功能調(diào)節(jié)，具有調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶功能的細(xì)胞因子，并且其表達(dá)水平隨年齡的增加而減少［8］。所以IGF－1蛋白的異常降低可能與阿爾茨海默病的發(fā)病有關(guān)［9］。本次實(shí)驗(yàn)中觀察組大鼠腦組織中的IGF－1蛋白表達(dá)水平與其他兩組相比下降，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降，這提示IGF－1蛋白表達(dá)水平下降會(huì)促進(jìn)阿爾茨海默病的發(fā)生。

Caspase－3蛋白一種重要的細(xì)胞凋亡蛋白，可以通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［10］。Caspase－3蛋白的異常活化與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)中觀察到，觀察組大鼠腦組織中Caspase－3蛋白表達(dá)相對(duì)于其他兩組增多，這提示該蛋白在腦組織中的表達(dá)增加會(huì)加重大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，造成大鼠的神經(jīng)功能異常，學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知能力下降，與阿爾茨海默病的發(fā)生密切相關(guān)。

通過對(duì)阿爾茨海默病大鼠模型的IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達(dá)水平的觀察可以進(jìn)一步揭示AD的發(fā)病機(jī)制，為AD的治療提供新的方向，有利于從基因水平和分子水平研究AD的有效治療途徑。

綜上，阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長(zhǎng)因子－1蛋白表達(dá)下降，Caspase－3蛋白表達(dá)增加；IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

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Observation of Alzheimer＇s disease model rats of insulin like growth factor－1 and Caspase－3 protein expression

WANG Xuan，WU Cheng－ji，DONG Shu－xin，et al.（First Affiliated Hospital of Jiamusi University Department of Neurology，Jia Mu－si 154000，China）

Objective To observe the change of insulin like growth factor－1and Caspase－3protein expression in Alzheimer＇s disease model rats.Methods 90Wister rats，weight in the range of（240±10g）with normal cognitive function，were randomly divided into three groups，named as the normal group；the control group（normal saline control group（observation group）；Alzheimer＇s disease model rats）.Determination of brain tissues of insulin like growth factor－1with radioimmunoassay（IGF－1），the expression of caspase－3protein by Western blotting.Results the IGF－in the brain tissue of model group rats 1protein expression is lower than the normal group；the observation group in brain tissues of rats with Caspase－3protein expression increased significantly.Comparison between groups with significant difference（P＜0.05）.Conclusion expression of IGF－1protein decreased in the model of brain tissue of Alzheimer＇s disease rats，expression of IGF－1protein was increased.IGF－1protein and IGF－1protein play roles in the development of Alzheimer＇s disease.

Blzheimer＇s disease；Aβ1－40；IGF－1；caspase－3

R749

A

王璇（1973－），副主任醫(yī)師，碩士。研究方向：腦血管病發(fā)病機(jī)制及治療。

2014－08－17）

1007－4287（2015）06－0874－03

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2011C053）

＊通訊作者