葉乃芳，凌華志，黃 穎，沈繼錄，徐元宏，王中新

16S rRNA序列分析技術(shù)對臨床標(biāo)本中疑難細(xì)菌的鑒定

葉乃芳，凌華志，黃 穎，沈繼錄，徐元宏，王中新

目的應(yīng)用16S rRNA序列分析技術(shù)鑒定臨床少見或疑難細(xì)菌，提高細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。方法收集臨床少見或疑難細(xì)菌44株，提取DNA，采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及目的片段基因測序，并將測序結(jié)果在核酸數(shù)據(jù)庫中比對分析以確定菌種。結(jié)果44株臨床少見或疑難細(xì)菌均擴(kuò)增到16S rRNA目的基因片段并成功測序，40株（90.9%）鑒定到“種”，4株（9.1%）鑒定到“屬”；其中常規(guī)方法與測序方法在“屬”水平一致的有34株（77.3%），不一致的有10株（22.7%）。結(jié)論16S rRNA序列分析技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速地鑒定臨床少見或疑難細(xì)菌，可以作為臨床細(xì)菌鑒定的重要方法之一。

16S rRNA基因；序列分析；細(xì)菌；鑒定

隨著人口老齡化、抗生素不恰當(dāng)使用、免疫抑制劑應(yīng)用及細(xì)菌培養(yǎng)條件的不斷改進(jìn)，臨床標(biāo)本培養(yǎng)出越來越多用常規(guī)方法難以鑒定的細(xì)菌。如何對這類細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確快速地鑒定，是臨床微生物室的一項(xiàng)重要任務(wù)。人類基因組計(jì)劃的完成以及后基因組計(jì)劃的實(shí)施，利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)通用引物擴(kuò)增16S rRNA基因片段的方法已經(jīng)日趨成熟，并廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域。目前，幾乎全部原核生物的16S rRNA基因序列已成功測序，并保存在公共的核酸序列數(shù)據(jù)庫中，可以迅速進(jìn)行基因序列的同源性分析。該研究應(yīng)用16S rRNA序列分析對44株臨床少見或疑難細(xì)菌進(jìn)行鑒定，以評估該技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株選取2013年9月～2014年9月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科分離的44株少見或疑難細(xì)菌。少見或疑難細(xì)菌入選標(biāo)準(zhǔn)：①臨床較少見或較難鑒定的細(xì)菌；②形態(tài)及生化反應(yīng)不典型；③菌株分離部位特殊；④生長緩慢、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定耗時(shí)較長、可信度低或無鑒定結(jié)果的細(xì)菌。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213金黃色葡萄球菌、ATCC 25922大腸埃希菌、ATCC 27853銅綠假單胞菌、ATCC 17666嗜麥芽窄食單胞菌、ATCC 29212糞腸球菌來評價(jià)16S rRNA序列分析鑒定細(xì)菌的準(zhǔn)確性。所有菌株保存于－80℃冰箱。

1.2 試劑與儀器Mueller-Hinton Broth肉湯（英國OXOID公司）；細(xì)菌DNA抽提試劑盒與PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工生物公司）；DL 2 000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；PCR擴(kuò)增儀（德國Biometra公司）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及配套GN、GP、NH、ANC鑒定卡片（法國生物梅里埃公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 細(xì)菌總DNA提取將全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定過的純菌落接種于配置好的Broth肉湯37℃搖菌過夜，取過夜菌液室溫8 000 r／min離心1 min，取沉淀按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒步驟提取細(xì)菌DNA。

1.4 16S rRNA基因擴(kuò)增參照文獻(xiàn)［1］，選用16S rRNA基因細(xì)菌通用引物（27上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），引物由上海生工生物公司合成。PCR反應(yīng)體系（50 μl）：上游引物（10 μmol／L）及下游引物（10 μmol／L）各2 μl、DNA模板1 μl、PCR Master 25 μl（含dNTPs、Taq DNA酶、Mg2＋）、加入滅菌去離子水22 μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。

1.5 PCR產(chǎn)物電泳取PCR產(chǎn)物5 μl于1%瓊脂糖電泳，使用5 μl DL 2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)。溴乙錠染色后通過凝膠成像儀觀察，確認(rèn)目標(biāo)基因擴(kuò)增成功后，PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司，對PCR產(chǎn)物純化后測序，測序引物使用PCR擴(kuò)增引物。

1.6 PCR產(chǎn)物測序分析將測得的序列用DNAMAN軟件進(jìn)行序列校正，去除兩端圖譜不清的序列，并對雙向測通結(jié)果進(jìn)行拼接。登陸GenBank和核糖體工程數(shù)據(jù)庫（RDP），在GenBank應(yīng)用BLAST

對獲得的基因片段進(jìn)行同源性檢索比對，初步得到細(xì)菌“屬”信息，以LPSN（http：／／www.bacterio.cict. fr）網(wǎng)頁中篩選模式菌株，參考CLSI MM18-A解釋標(biāo)準(zhǔn)［2］：①與模式菌株相似度≥99.0%且與其他種相似度之差＞0.8%，報(bào)告其種名；②與多個(gè)菌種的模式菌株相似度≥99.0%且相似度之差＜0.8%，則為“低鑒定度”的鑒定，應(yīng)報(bào)告其屬名和所有相似度≥99.0%的種名；③與某屬細(xì)菌的相似度在97.0%～98.9%之間且能與其他菌屬相區(qū)分，報(bào)告其屬名并備注“親緣關(guān)系最近的菌種”；④與所有菌種的模式菌株相似度＜97%，則報(bào)告為可能的新屬新種。在RDP數(shù)據(jù)庫序列比對界面，Options中勾選上符合的Strain、Source、Size、Quality、Taxonomy，篩選excellent水平（高準(zhǔn)確性）片段［3］。

1.7 兩種方法鑒定結(jié)果分析比較VITEK 2 COMPACT系統(tǒng)與16S rRNA序列分析結(jié)果同時(shí)對實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)一步復(fù)核生物學(xué)特點(diǎn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，兩方法鑒定水平差異（計(jì)數(shù)資料）用配對χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA基因鑒定5株標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA基因所測序列與核酸數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)菌株作比對分析結(jié)果完全符合。

2.2 44株實(shí)驗(yàn)菌株電泳結(jié)果經(jīng)過16S rRNA基因PCR擴(kuò)增，電泳凝膠系統(tǒng)成像，均在1 500 bp處獲得陽性產(chǎn)物，與預(yù)計(jì)片段大小吻合。見圖1。

2.3 VITEK 2 COMPACT系統(tǒng)與16S rRNA序列分析44株實(shí)驗(yàn)菌株有34株（77.3%）常規(guī)方法與測序方法在屬水平一致，10株（22.7%）兩種方法在屬水平不一致。見表1。進(jìn)一步復(fù)核生物學(xué)特點(diǎn)。見表2。

2.4 兩種方法鑒定水平比較VITEK 2 COMPACT 將31株（70.5%）鑒定到種水平，7株（15.9%）只鑒定到屬水平，6株（13.6%）未能鑒定。測序分析40株（90.9%）鑒定到種水平，4株（9.1%）鑒定到屬水平，兩種方法鑒定水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.022）。16S rRNA序列分析鑒定到種水平成功率為90.9%，常規(guī)方法鑒定成功率為70.5%，提示16S rRNA序列分析的鑒別能力明顯高于常規(guī)方法。

3 討論

本研究運(yùn)用16S rRNA序列分析技術(shù)，對臨床少見或疑難細(xì)菌進(jìn)行鑒定，鑒定到種水平成功率為90.9%，而常規(guī)方法鑒定成功率為70.5%，與研究［4］一致，可見16S rRNA序列分析的鑒別能力明顯高于常規(guī)方法。

16S rRNA序列分析是臨床細(xì)菌鑒定的重要方法之一。首先，對常規(guī)方法只鑒定到屬的細(xì)菌鑒定至種，如本研究幾例不動(dòng)桿菌屬的鑒定。不動(dòng)桿菌屬生化反應(yīng)相近，很難準(zhǔn)確鑒定到種，統(tǒng)稱為乙酸鈣－鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群，使用16S rRNA序列分析可以將部分不動(dòng)桿菌鑒定至種［5］。不僅能提供正確結(jié)果，選擇合適的治療時(shí)機(jī)，還能進(jìn)一步了解其流行病學(xué)及致病角色。其次，使用16S rRNA序列分析技術(shù)提高鑒定可信度［6］，本研究中將可信度低的洛菲不動(dòng)桿菌準(zhǔn)確鑒定為約翰遜不動(dòng)桿菌，可能是洛菲不動(dòng)桿菌、約翰遜不動(dòng)桿菌枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、丙二酸鹽利用實(shí)驗(yàn)、精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)不穩(wěn)定引起；皮氏羅爾斯頓菌與臨床罕見的嗜銅菌屬表型非常相似，常規(guī)生化反應(yīng)鑒定比較困難，用16S rRNA序列分析可以鑒定出來。另外，16S rRNA序列分析技術(shù)可以準(zhǔn)確鑒定VITEK 2系統(tǒng)未能鑒定、生長緩慢的苛養(yǎng)菌、厭氧菌、少見菌等［7］。本研究中一株細(xì)菌在血平板呈粗糙針尖樣菌落，涂片革蘭陽性短桿狀，CAMP陰性，VITEK 2系統(tǒng)ANC卡未能鑒定，根據(jù)鏡檢形態(tài)、觸酶及改良抗酸染色陽性，初步判斷為馬紅球菌，進(jìn)一步測序分析，鑒定是馬紅球菌。查閱VITEK 2儀器相關(guān)說明，不包括馬紅球菌鑒定信息，未能鑒定的深黃奈瑟球菌和氧化微桿菌也不在VITEK 2系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中，VITEK 2數(shù)據(jù)庫需要定期更新。本研究中一例壺腹部穿刺液，菌落細(xì)小，生長緩慢，VITEK 2系統(tǒng)GP卡未能鑒定，測序結(jié)果為副血鏈球菌，參考文獻(xiàn)［8］記載副血鏈球菌常分離自深部膿腫，尤其是肝、腦膿腫，精氨酸陽性，甘露醇、山梨醇、尿酸均陰性，其他生化反應(yīng)不定；成功鑒定一株近十年內(nèi)命名的具有明確臨床意義的新細(xì)菌Corynebacterium resistens［9］。該細(xì)菌來自一位食管惡性腫瘤患者血培養(yǎng)標(biāo)本，為多重耐藥棒桿菌，與臨床醫(yī)師溝通認(rèn)為是感染菌，中國鮮有報(bào)道。

表1 VITEK 2 COMPACT系統(tǒng)與16S rRNA序列分析鑒定

表2 鑒定結(jié)果不一致的菌株生化反應(yīng)分析

序列比對分析使用GenBank及RDP數(shù)據(jù)庫，所含菌種目錄齊全，兩者比對結(jié)果基本吻合，但是比對伯克霍爾德菌屬分別歸屬吡咯伯克霍爾德菌及洋蔥伯克霍爾德菌，據(jù)Gee et al［10］報(bào)道，伯克霍爾德菌幾個(gè)種的堿基位點(diǎn)只有微小差異，相似率可達(dá)99%以上。另一方面不同數(shù)據(jù)庫搜集16S rRNA序列數(shù)據(jù)質(zhì)量和一致性均存在差異，Cloud et al［4］認(rèn)為任何方法的準(zhǔn)確性都依賴于數(shù)據(jù)庫的及時(shí)更新。16S rRNA序列分析由于選擇的引物序列保守，對部分近緣菌的分辨率低，且基因水平轉(zhuǎn)移、基因突變等均可能影響16S rRNA序列分析的準(zhǔn)確性［11］。常規(guī)法從標(biāo)本送檢到得出鑒定結(jié)果需要3～5 d，如果遇到難以鑒定的細(xì)菌可能需要更長時(shí)間，16S rRNA序列分析整個(gè)過程只需2～3 d。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將在傳統(tǒng)生化反應(yīng)鑒定的基礎(chǔ)上，恰當(dāng)應(yīng)用16S rRNA及其他管家基因的序列分析技術(shù)進(jìn)一步提高對細(xì)菌的鑒定能力。

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Application of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of clinical unidentifiable bacteria

Ye Naifang，Ling Huazhi，Huang Ying，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo apply an approach based on 16S rRNA gene sequences analysis for identification of clinical rare and unidentifiable bacteria in order to improve the accuracy of clinical diagnosis.MethodsA total of 44 clinical isolates were collected，the bacteria DNA was extracted followed by PCR amplification for 16S rRNA gene with a universal primer.The PCR products were sequenced.The confirmed sequences were compared to the reference sequences obtained from GenBank and RDP databases.ResultsAll of the 44 clinical isolates obtained the target genes successfully.40 strains（90.9%）were specified to the species level and 4 strains（9.1%）were specified to the genus level.77.3%（34／44）of sequencing results were concordant with phenotypic results，22.7%（10／44）of sequencing results were not concordant with phenotypic results.Conclusion16S rRNA gene sequence analysis can be accurate，rapid identification of clinical rare bacteria and bacteria with unusual phenotypic profiles.

16S rRNA gene；sequence analysis；bacteria；identification

R 446.5

A

1000－1492（2015）07－1000－04

2015－03－17接收

安徽省高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號：KJ2010A174）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230022

葉乃芳，女，碩士研究生；王中新，男，主任技師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aywzhx87＠163.com