韓 瓏 王正林 劉 輝 余宏鑄

脂多糖對正常人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞TLR4-NF-кB通路的影響

韓 瓏 王正林 劉 輝 余宏鑄

目的探討脂多糖(LPS)對正常人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(HiBECs)中TLR4-NF-кB通路的影響。方法HiBECs常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)后，加入不同濃度的LPS(0.1、1、4、8、10 μg/mL)，刺激不同時間(3、6、9、12、24 h)，用Realtime RT-PCR分析細(xì)胞內(nèi)TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平。結(jié)果LPS刺激HiBECs后TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平均增加，HiBECs在受到LPS(4 μg/mL)刺激后TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平隨時間延長而增加，于6小時達(dá)高峰，之后下降。以相同時間(6 h)刺激HiBECs后，TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平隨LPS濃度增高而增加，LPS濃度為4 μg/mL時達(dá)高峰，之后下降。結(jié)論LPS可以激活HiBECs中的TLR4-NF-кB通路，并且有時效和量效依賴關(guān)系。

人正常肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞；脂多糖；Toll樣受體4；核轉(zhuǎn)錄因子-кB

肝內(nèi)膽管可因結(jié)石梗阻導(dǎo)致局部膽汁淤積而反復(fù)發(fā)生細(xì)菌感染，造成膽道系統(tǒng)慢性炎癥環(huán)境的持續(xù)存在，是肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌變的主要誘因[1]。膽道系統(tǒng)感染多為革蘭氏陰性菌，其外壁層中具有一種特有的化學(xué)成分脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)。目前，關(guān)于LPS激活經(jīng)典炎癥通路LPS-TLR4-NF-кB報道很多[2-4]，但研究多集中于腫瘤組織和人體其他正常組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)，而LPS作用于正常人肝內(nèi)膽管細(xì)胞(human intrahepatic biliary epithelial cells，HiBECs)，激活該通路，并使正常細(xì)胞瘤變的研究較少。本研究在體外細(xì)胞實驗中檢測LPS對HiBECs中TLR4-NF-кB通路的影響，以期了解受感染的細(xì)胞瘤變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 正常人肝內(nèi)膽管細(xì)胞(HiBECs)為一代細(xì)胞，購自上海雷蒂生物科技發(fā)展有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；四季青胎牛血清購自浙江天杭生物技術(shù)有限公司；RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas Life Sciences；RNAiso Reagent、Real-time PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；所有引物均采用primer 5.0軟件設(shè)計，由上海生工生物工程公司合成(見表1)。RIPA裂解液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗TLR4多克隆抗體、兔抗NF-κB多克隆抗體購自美國Biogot Biotechnology公司；羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗購自北京中山金橋生物有限公司；增強化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒(ECL發(fā)光劑)購自碧云天生物技術(shù)研究所。

表1 Realtime RT-PCR分析HiBECs中目的基因及內(nèi)參的引物序列

1.2 人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng) RPMI 1640培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、105U/L青霉素、105U/L鏈霉素，為完全培養(yǎng)基，人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(HiBECs)用完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%濕度的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)80%時，換成不含青霉素、鏈霉素，含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為正常對照組(NC組)、不同濃度的LPS組，LPS組加入不同濃度的LPS(0.1、1、4、8、10 μg/mL)分別刺激3、6、9、12、24 h，收集細(xì)胞進行RT-PCR檢測。

1.3 TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)的檢測 提取各組HiBECs細(xì)胞總RNA，RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，Realtime RT-PCR分析TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平，在美國ABI公司StepOnePlus儀上進行擴增，用比較Ct法(△△Ct)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激HiBECs不同時間點TLR4-NF-κB的表達(dá) 與NC組相比，LPS(4 μg/mL)刺激HiBECs后TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平均增加(P<0.05)，表明LPS激活HiBECs中TLR4-NF-κB通路，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。與NC組相比，TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)量在LPS刺激6小時達(dá)高峰：TLR4 mRNA增加35.00倍(P=0.036)、NF-κB mRNA增加了6.55倍(P=0.030)，此后隨刺激時間延長，表達(dá)量下降，LPS(9小時)組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平較LPS(6小時)組下降(P<0.05)，6 h為效應(yīng)最強的刺激作用時間。TLR4 mRNA與NF-κB mRNA表達(dá)量之間存在正相關(guān)(r=0.979，P<0.05)。詳見圖1。

圖1 LPS刺激HiBECs不同時間點TLR4、NF-κB mRNA的表達(dá)情況

NC與LPS組(4 μg/mL)：3、6、9、12、24小時與NC組相比：*P<0.05；各實驗組與LPS(6小時)組相比，**P<0.05；TLR4 mRNA與NF-κB mRNA表達(dá)量之間存在正相關(guān)性(r=0.979，P<0.05)

2.2 不同濃度的LPS對HiBECs中TLR4-NF-κB通路的影響 與NC相比，在一定范圍內(nèi)(≤4 μg/mL)，隨著LPS濃度的增加，HiBECs中TLR4、NF-κB mRNA的表達(dá)水平均逐漸增加，但高濃度(≥8 μg/mL)LPS的刺激效應(yīng)逐漸降低，TLR4、NF-κB mRNA的表達(dá)水平均減少，LPS(8 μg/mL)組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平較LPS(4 μg/mL)組下降(P<0.05)，4 μg/mL為效應(yīng)最強的刺激濃度。TLR4 mRNA與NF-κB mRNA表達(dá)量之間存在正相關(guān)(r=0.975，P<0.05)。詳見圖2。

2.3 LPS對HiBECs中TLR4-NF-κB蛋白表達(dá)影響 使用效應(yīng)最強的刺激濃度及刺激持續(xù)時間，即4 μg/mL LPS 刺激HiBECs 6 h后，從蛋白水平檢測TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平，與NC相比，LPS組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。詳見圖3。

圖2 不同濃度的LPS對HiBECs中TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)的影響

NC與LPS組(6小時)：0.1、1、4、8、10 μg/mL與NC組相比：*P<0.05；各實驗組與LPS(4 μg/mL)組相比，**P<0.05；TLR4 mRNA與NF-κB mRNA表達(dá)量之間存在正相關(guān)性(r=0.975，P<0.05)

圖3 4 μg/mL LPS刺激HiBECs 6 h對TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

NC與LPS組(4 μg/mL，6小時)相比：*P<0.05

3 討論

炎癥參與機體對外界感染的防御機制，然而，反復(fù)慢性炎癥刺激卻與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。有研究[8]表明，約15%～20%腫瘤的發(fā)生發(fā)展與感染引起的炎癥有關(guān)。全球每年大約有120萬例腫瘤病例可歸結(jié)于慢性感染[9]，如幽門螺桿菌感染引起胃癌，念珠菌感染與口腔癌，EB病毒感染與鼻咽癌，乙型肝炎病毒感染與肝細(xì)胞癌等。在我國，肝內(nèi)膽管結(jié)石與肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病密切相關(guān)[10]。有文獻(xiàn)[11]報道在肝內(nèi)膽管結(jié)石基礎(chǔ)上肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生率為11.7%～12.5%。膽道感染的細(xì)菌主要為革蘭氏陰性菌[12]，其細(xì)菌外壁層中具有的LPS是介導(dǎo)炎癥通路TLR4-NF-κB產(chǎn)生應(yīng)答的主要配體。現(xiàn)已有較多研究證實，TLR4-NF-κB通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系[13]，而且有相關(guān)研究表明NF-κB在肝內(nèi)膽管結(jié)石合并肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織呈過表達(dá)[14,15]。但多集中于LPS作用于人體腫瘤細(xì)胞和人體其他正常組織細(xì)胞的研究，而LPS對正常人肝內(nèi)膽管細(xì)胞(HiBECs)作用的報道卻很少。

TLR4是Toll樣受體家族(Toll like receptor，TLR)成員之一。TLR是一類天然免疫受體，幾乎分布于所有的細(xì)胞系。人類膽管上皮細(xì)胞主要表達(dá)TLR1-10[16]，其中TLR4是介導(dǎo)LPS應(yīng)答的最主要受體[17]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS在一定濃度范圍及作用時間范圍內(nèi)刺激HiBECs，使TLR4 mRNA表達(dá)量增加，提示炎癥刺激物L(fēng)PS與TLR4受體結(jié)合后，將炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，促使細(xì)胞合成更多的TLR4受體。

LPS與TLR4結(jié)合后主要通過兩條不同途徑激活NF-κB：一條是髓樣分化因子88(MyD88)依賴的信號通路；另一條為MyD88非依賴的信號通路。NF-κB作為“炎癌鏈”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，調(diào)控眾多基因的轉(zhuǎn)錄，影響機體免疫、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與增殖等多種活動。另外，在多種腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲調(diào)控中也發(fā)揮中樞性作用[5,6]。HiBECs在低濃度LPS及短時間刺激時，NF-κB mRNA的表達(dá)量并不高。本實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)LPS濃度增加到4 μg/mL，持續(xù)作用時間延長至6 h時，NF-κB mRNA的表達(dá)量最高。此時，LPS一方面使NF-κB mRNA表達(dá)增加，使蛋白質(zhì)合成增加，另一方面，LPS通過信號傳遞，激活NF-κB依賴性蛋白激酶NIK和IκB蛋白激酶，最終使IκB降解，從而激活NF-κB，使之產(chǎn)生核轉(zhuǎn)信號[18]。LPS刺激的強弱，刺激持續(xù)的時間與機體細(xì)胞對炎癥刺激的反應(yīng)，決定了正常肝內(nèi)膽管細(xì)胞是走向修復(fù)或是炎癥死亡，甚至惡性轉(zhuǎn)化，這對研究發(fā)病機制有重要意義。

本實驗中，加入不同刺激時間(3、6、9、12、24 h)和不同濃度(0.1、1、4、8、10 μg/mL)的LPS，TLR4和NF-кB mRNA表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)均增加，隨后下降。提示LPS可以激活HiBECs中的TLR4-NF-κB炎癥通路，且LPS對HiBECs內(nèi)TLR4-NF-кB通路的激活具有時效及量效依賴關(guān)系。這種時效與量效反應(yīng)關(guān)系也體現(xiàn)在其他組織中，如巨噬細(xì)胞和人牙周膜細(xì)胞[19,20]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，NF-κB mRNA的表達(dá)量變化與TLR4幾乎一致，TLR4 mRNA與NF-κB mRNA表達(dá)量之間存在正相關(guān)，這與人體牙周膜細(xì)胞的體外實驗結(jié)果相同[16]，也與Obando-Pereda等[21]的結(jié)果相同。說明細(xì)胞外刺激信號LPS通過TLR4-NF-κB激活了細(xì)胞內(nèi)的炎癥通路，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括IκB、黏附分子、COX-2以及各種細(xì)胞因子和趨化因子等[13,22]，這些因子能夠形成一個特殊的微環(huán)境。如果這個微環(huán)境發(fā)生在正常組織周圍，將直接誘導(dǎo)細(xì)胞中抑癌基因或癌基因的突變, 使正常細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。

本研究同時觀察到LPS作用6 h，TLR4和NF-кB mRNA表達(dá)水平達(dá)高峰，此后隨著LPS刺激時間延長，TLR4、NF-кB mRNA表達(dá)水平逐漸下降，至24小時逐漸穩(wěn)定于一較高水平，提示LPS激活了LPS-TLR4-NF-кB通路的同時，可能也激活了細(xì)胞清除LPS，抑制細(xì)胞內(nèi)炎癥通路表達(dá)的機制，這體現(xiàn)了HiBECs具有自身的內(nèi)毒素耐受性，與Harada[23]等的研究結(jié)果相同。這種性質(zhì)體現(xiàn)了膽道系統(tǒng)先天的免疫性，并且維持膽道系統(tǒng)局部環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

總之，LPS可以激活HiBECs中TLR4-NF-κB通路，使細(xì)胞表達(dá)各種炎癥因子，介導(dǎo)細(xì)胞炎癥損傷。不同的損傷程度及細(xì)胞恢復(fù)程度將導(dǎo)致細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)歸，可能是肝內(nèi)膽管結(jié)石引起局部長期慢性炎癥，最終導(dǎo)致正常肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌變的發(fā)病機制。此外HiBECs特有的內(nèi)毒素耐受性質(zhì)為其提供了一道抵御細(xì)胞慢性炎癥的屏障，維持膽道局部環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而這種膽道系統(tǒng)自身免疫性質(zhì)的破壞與失衡也可能為探討膽道感染、膽道炎癥和膽道腫瘤等疾病的發(fā)生與發(fā)展提供新的線索，有待進一步深入研究。

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(2015-01-20收稿 2015-03-19修回)

Effect of LPS on TLR4-NF-кB pathway in human intrahepatic biliary epithelial cells

HanLong,WangZhenglin,LiuHui,etal

DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China

Objective To investigate the effect of lipopolysaccharides (LPS) on TLR4-NF-кB pathway in human intrahepatic biliary epithelial cells (HiBECs) in vitro.Methods HiBECs were cultured and divided into normal control group (NC) and LPS group. LPS group was treated with LPS at different time (3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 24 h)and different concentrations (0.1, 1, 4, 8, 10 μg/mL). The expression of TLR4 and NF-кB was assessed by realtime-PCR and Western blot.Results LPS upregulated the expression of TLR4 and NF-кB in HiBECs. The TLR4 and NF-κB mRNA transcription was increased at different time of LPS stimulation, and reached its peak on 6 h and then gradually decreased. Simultaneously, the TLR4 and NF-κB mRNA expression level was increased in a dose-dependent manner,and reached its peak when used at 4 μg/mL LPS and then decreased.Conclusion LPS activates TLR4-NF-кB signaling in HiBECs in a time-and dose-dependent manner.

Human intrahepatic biliary epithelial cells；Lipopolysaccharides；Toll-like receptor 4；Nuclear factor-κB

安徽省年度重點科研項目(1301043034)

230022 合肥 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科

余宏鑄，hongzhu.620929@aliyun.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.07.034