喬立業(yè)，方 李，曹燕麗，陸 崟，蘇 華，王曙東（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇南京210002）

高效液相色譜法測(cè)定新保腎片中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量

喬立業(yè)，方 李，曹燕麗，陸 崟，蘇 華，王曙東（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇南京210002）

目的建立新保腎片中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量測(cè)定方法，為生產(chǎn)質(zhì)量提供保障。方法采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜柱為L(zhǎng)ichrospher-C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇∶0．1%磷酸溶液（70∶30），流速為1．0 m l／min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別在2．30～18．4μg／m l（r＝1．0）、2．930～23．44μg／m l（r＝1．0）、5．00～40．0μg／m l（r＝1．0）、14．870～118．96μg／m l（r＝0．999 8）、7．410～59．28μg／m l（r＝0．999 9）范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為100．16%、102.91%、99．76%、100.32%、100．44%，RSD分別為1．58%、1．27%、1．67%、1．33%、1．03%（n＝9）。結(jié)論該方法準(zhǔn)確易行，便于質(zhì)量控制。

蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；高效液相色譜法；含量測(cè)定

新保腎片是以大黃醇浸膏提取物為有效成分的制劑，能夠?yàn)a熱通腸，逐瘀通經(jīng)，延緩各類腎小球疾病的進(jìn)展，尤其適用于硬化性腎小球腎炎，主治各類腎功能衰竭和各期糖尿病性腎病。其原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅采用分光光度法對(duì)大黃素進(jìn)行測(cè)定，為了更好地把握產(chǎn)品質(zhì)量，在查閱相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)大黃醇浸膏的質(zhì)量控制方法后［1］，我們采用HPLC法測(cè)定該制劑中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供一種準(zhǔn)確有效的測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1．1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀（四元泵、VWD紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫有限公司），KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），AE240電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一），F(xiàn)A1604S電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，精度為萬(wàn)分之一）。

1．2試藥 蘆薈大黃素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，110795-201007，純度為98．0%），大黃酸對(duì)照品（110757-200206）、大黃素對(duì)照品（110756-200110）、大黃酚對(duì)照品（110796-201118，純度為99．5%）、大黃素甲醚對(duì)照品（110758-201013，純度為99．8%）（上述對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究所提供），新保腎片（醫(yī)院制劑，批號(hào)121107、121206、131023），磷酸（南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)12041910634），甲醇（色譜純，美國(guó)天地），水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1色譜條件的選擇 色譜柱：Lichrospher-C18柱，（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇∶0．1%磷酸溶液（70∶30）；流速：1．0 m l／min；進(jìn)樣量：10μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35℃。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的保留時(shí)間分別約為10、16、30、42、67 min。

2．2溶液的制備①對(duì)照品溶液：精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品2．30、2．93、5．00、14．87、7．41 mg置100 m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為儲(chǔ)備液。精密稱取4 m l儲(chǔ)備液置10 m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液，濃度分別為9．20、11.72、20．00、59．48、29．64μg／m l。②供試品溶液：取本品20片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取0．3 g置平底燒瓶中，加甲醇50 m l，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減重，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。③陰性對(duì)照溶液：按處方比例和樣品制備工藝不含大黃制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液，按上述方法進(jìn)行測(cè)定。陰性樣品在蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚吸收峰處均無(wú)峰出現(xiàn)，表明其對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2．3線性關(guān)系考察 分別精密量取“2．2”項(xiàng)下的混合儲(chǔ)備液1．0、2．0、4．0、6．0、8．0 m l置10 m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積Y對(duì)濃度X作線性回歸，計(jì)算回歸方程（見表1），結(jié)果表明各成分分別在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 5種蒽醌類成分的回歸方程及線性范圍（n＝5）

2．4精密度試驗(yàn) 取“2．2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0．68%、0．75%、0．21%、0．16%、1．02%。結(jié)果表明該方法的精密度良好。

2．5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)為131023）的樣品5份，按“2．2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行測(cè)定，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚平均含量分別為0．62、0．67、1．20、4．23、1．19 mg／片，RSD分別0．84%、1．69%、1．60%、1．37%、1．53%。說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2．6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)為131023）的供試品溶液，在常溫下分別于0、1、2、4、8 h進(jìn)樣，記錄峰面積，RSD分別為0．42%、0．31%、0．32%、0.21%、0．36%。表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量（批號(hào)為131023）的樣品0．15 g，共9份，分別置于平底燒瓶中，按80%、100%、120%3個(gè)濃度分別精密加入“2．2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5、8、10 m l，按“2．2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，即得。精密吸取上述供試液10μl注入色譜儀，測(cè)定含量，結(jié)果見表2、3、4、5、6。2．8 樣品含量測(cè)定 取3批新保腎片，按“2．2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果見表7。

表2 蘆薈大黃素加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n＝9）

表3 大黃酸加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n＝9）

表4 大黃素加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n＝9）

表5 大黃酚加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n＝9）

表6 大黃素甲醚加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n＝9）

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg／片）

綜合3批樣品測(cè)定結(jié)果，確定本品每片含大黃以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚總量計(jì)不得少于5．0 mg。

3 討論

大黃的化學(xué)成分復(fù)雜，所含的有機(jī)化合物眾多，在采用甲醇-0．1%磷酸溶液（75∶25）、甲醇-1%醋酸溶液（75∶25）和甲醇-0．1%磷酸溶液（78∶22）等流動(dòng)相后發(fā)現(xiàn)磷酸系統(tǒng)比醋酸系統(tǒng)更穩(wěn)定［2，3］，峰形更佳，雖然有機(jī)相的減少延長(zhǎng)了分析時(shí)間，但更利于主成分和雜峰的分離，同時(shí)相較于梯度洗脫簡(jiǎn)便易行，故選擇了甲醇-0．1%磷酸溶液（70∶30）作為合適的流動(dòng)相。

通過(guò)與我院同類制劑的含量對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)新保腎片中大黃素和大黃酚的含量更高，同時(shí)有研究表明此類成分對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌等均具有較好的抑制作用，且能夠通過(guò)降低細(xì)胞高代謝狀態(tài)來(lái)治療慢性腎衰竭［4-6］，故從一個(gè)方面驗(yàn)證了該制劑的有效性。另外，中藥的成分復(fù)雜，從西藥的角度去研究一些指標(biāo)性成分并不能代表整體的作用，所以我們需要建立一個(gè)屬于中藥的可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部［S］．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22．

［2］ 李 平，鄭艷春，楊冬麗，等．HPLC同時(shí)測(cè)定新健胃包芯片中5種蒽醌類成分的含量［J］．中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15（5）：406-409．

［3］ 徐守竹，謝艷華，張曉衛(wèi)，等．RP-HPLC同時(shí)測(cè)定腎康注射液中5種蒽醌類成分［J］．中成藥，2010，26（21）：90-93．

［4］ 曾 芳，李 媛．大黃有效化學(xué)成分及其藥理作用［J］．當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19（12）：149-150．

［5］ 王昕怡，邵加慶．腎功能不全患者的降糖治療［J］．醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26（4）：442-446．

［6］ 林小鳳，李明權(quán)，李 琦，等．慢性腎臟病的中西醫(yī)治療進(jìn)展［J］．黑龍江醫(yī)藥，2012，1：43-45．

Determ ination of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion in Xinbaoshen tablets by HPLC

QIAO Liye，F(xiàn)ANG Li，CAO Yanli，LU Yin，SU Hua，WANG Shudong（Departmentof Preparation，Nanjing General Hospital of Nanjing M ilitary Region，PLA，Nanjing 210002，China）

ObjectiveTo establishmethod of the determination of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanoland physcion in Xinbaoshen tablet，for the production of quality protection．MethodsHPLC was performed on a Lichrospher-C18column（250mm×4．6mm，5μm）with themobile phase ofmethanol-0．1%H3PO4（70∶30）．The flow rate was 1．0 m l／min，the column temperature was at 35℃and the detection wavelength was 254 nm．ResultsThe linear rang of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion were obtained between 2．30-18．4μg／m l（r＝1．0），2．930-23．44μg／m l（r＝1．0），5．00-40．0μg／m l（r＝1．0），14．870-118．96μg／m l（r＝0．9998）and 7．410-59．28μg／m l（r＝0．999 9），the average recoverieswere 100．16%，102．91%，99．76%，100．32%，100．44%，RSD were 1．58%，1．27%，1．67%，1．33%，1．03%（n＝9）．ConclusionThe improvedmethod was accurate and feasible which could be used convenient in quality control．

aloe-emodin；rhein；emodin；chrysophanol；physcion；HPLC；content determ ination

R917

A

1006-0111（2015）05-0438-03

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．015

2014-05-27

2014-07-30

［本文編輯］ 顧文華

全軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZJZ13）

喬立業(yè)，碩士，藥師．E-mail：qlynjutcm＠sina．com

王曙東，博士，主任藥師．研究方向：中藥制劑．Tel：（025）80860166；E-mail：suhuash＠sina．com．cn