曾詠芳,曹佳媛,楊可妍,吳 軍,覃雨陽,熊 毅
(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005;2.廣西區(qū)動物疫病預(yù)防與控制中心,廣西南寧 530001)
豬瘟是由豬瘟病毒 (Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重,造成了嚴(yán)重的損失,是世界糧農(nóng)組織和各國政府嚴(yán)密監(jiān)控和檢疫的主要傳染病之一[1]。豬瘟病毒是黃病毒科瘟病毒屬成員,具有囊膜的單股正鏈RNA病毒,基因組長度約12.5kb,含單一的開放閱讀框架,編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白,8種非結(jié)構(gòu)蛋白,其中E0和E2基因編碼主要的囊膜糖蛋白,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。E0蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白,也是一種多功能性蛋白,具有神經(jīng)毒性及轉(zhuǎn)導(dǎo)特性參與病毒粒子黏附和侵入宿主細(xì)胞的過程,并且能夠通過介導(dǎo)宿主淋巴細(xì)胞的凋亡而使宿主產(chǎn)生免疫抑制導(dǎo)致持續(xù)感染[2]。在病毒粒子中,E0糖蛋白以分子質(zhì)量為100ku的同源二聚體的形式存在,但E0并不像E2那樣具有跨膜區(qū),而是以一種未知機(jī)制連接在病毒粒子的表面上,對CSFV在細(xì)胞中的復(fù)制、表達(dá)和調(diào)控過程起重要作用[3]。E0蛋白具有RNase活性,其C端區(qū)域可控制CSFV感染過程中的病毒對真核細(xì)胞膜的遷移并具有抑制雙鏈RNA誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)。王琴等[4]通過對10個(gè)流行株與SM株E0基因的比較分析,發(fā)現(xiàn)我國CSFV具有復(fù)雜性、多樣性和相對的遺傳穩(wěn)定性;王家富等[5]利用RT-PCR的方法,擴(kuò)增并克隆了HCLV和石門強(qiáng)毒株完整的E0糖蛋白基因并進(jìn)行了序列測定。E0是CSFV的一個(gè)重要蛋白,在長期的進(jìn)化中仍保持RNase活性,其RNase具有多種功能,與許多生物過程有關(guān)。E0可抑制多種動物淋巴細(xì)胞的蛋白合成及引起淋巴細(xì)胞凋亡,CSFV感染的豬存在白細(xì)胞減少和免疫抑制,這些結(jié)果提示E0在CSFV的致病過程中起著重要作用。因此,對E0基因的研究有十分積極的意義,通過對6株廣西豬瘟病毒流行株與4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株E0基因的序列及推導(dǎo)蛋白的分析,可以更切合實(shí)際的了解廣西豬瘟流行毒株與豬瘟4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株之間的差異,為其變異規(guī)律提供理論依據(jù),從而為制定更有效防控CSFV的措施奠定了基礎(chǔ)。
1.1.1 主要儀器與試劑 總RNA抽提試劑盒、DNA Marker DL 2 000、膠回收試劑盒、DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒抽提取試劑盒等為天根生化有限公司產(chǎn)品;Ex Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、HIR 抑制酶、dNTPs、Mgcl2、PMD18-T 質(zhì)粒載體、限制性內(nèi)切酶等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;PCR儀、超速離心機(jī)、移液器等。
1.1.2 病毒 豬瘟病毒野毒株陽性病料由廣西動物疫病預(yù)防控制中心家畜診斷科鑒定并保存,擴(kuò)增的6株E0基因分別編號為GX1~GX6,病料來自廣西陸川縣。
1.2.1 引物的合成與設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的CSFV全基因組序列,通過Oligo軟件設(shè)計(jì)了擴(kuò)增E0基因的引物對E0-1/E0-2,預(yù)期擴(kuò)增長度為887bp,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。將其稀釋成25pmol/μL,置-20℃分裝,備用。
1.2.2 病毒RNA的提取 按天根生化有限公司總RNA提取試劑盒方法提取RNA,最后溶于30μL ddH2O。
1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA 將獲得的病毒RNA根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系為5×M-MLV RTase Reaction buffer 5μL,dNTPs(10mmol/L)2μL,下游引物 E0-2(25pmol/μL)2μL,RNasin inhibitor(40U/μL)0.5μL,M-MLV RTase(200U/μL)0.5μL,RNA模板15μL。PCR反應(yīng)條件:42℃,1h;94℃,5min,反應(yīng)結(jié)束后獲得豬瘟病毒cDNA。
1.2.4 目的基因的PCR擴(kuò)增 用E0引物對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:ddH2O 14.5μL,10×ExTaq bufffer 2.5 μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,上、下游引物各0.5μL,ExTaq酶0.1μL,cDNA 模板5.0μL,共25μL 體系。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min;94℃45s,56℃45s,72℃1min 30s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠上電泳,125V電泳35min,置凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。
1.2.5 目的基因的膠回收、連接、酶切鑒定及克隆測序 膠回收按照天根生化有限公司膠回收試劑盒進(jìn)行。按DNA連接試劑盒將回收純化后的目的基因與pMD18-T載體連接,連接后4℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ中,涂布于添加有Amp(100μg/mL)的LA培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)12h~16h,挑取上述生長良好的白色菌落,接至含有Amp(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基,37℃搖床培養(yǎng)16h。取3mL培養(yǎng)物提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切及質(zhì)粒PCR鑒定,篩選出兩者均為陽性的菌株送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析表明,利用自設(shè)E0基因的特異性引物擴(kuò)增出長度為887bp左右的條帶,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。陽性對照為豬瘟兔化弱毒苗(HCLV)。
圖1 CSFV E0基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR products of CSFV E0gene
6株E0基因的2個(gè)片段重組質(zhì)粒用(SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切),可見887bp和2 650bp左右的2個(gè)片段,分別為目的基因和pMD18-T載體,與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。
圖2 CSFV E0基因酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of enzyme digestion products of CSFV E0gene
本試驗(yàn)分離得到的6株廣西毒株與HCLV(登錄號:AF091507.1)、Shimen(登錄號:AF092448.2)、Paderborn(登錄號:GQ902941.1)、GXWZ02(登錄號:AY367767)核苷酸和氨基酸的同源性比對結(jié)果如表1所示。序列分析可知,廣西流行株與HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之間核苷酸的同源性分別為80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%,表明研究的6株廣西豬瘟流行株的E0基因發(fā)生了較大變異。
使用軟件MEGA4.1對6株毒株的E0基因進(jìn)行序列比對,并從GenBank上下載國內(nèi)外發(fā)表的毒株,構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖3)。
表1 6株廣西豬瘟病毒流行毒株與HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株E0基因核苷酸和氨基酸同源性比較Table 1 The nucleotide and amino acid homologous comparisons of E0gene among 6Guangxi CSWFV strain and HCLV strain,Shimen strain,Paderborn strain,GXWZ02strain %
圖3 CSFV E0基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of CSFV E0
如圖3所示,廣西流行毒株均分布于GenogroupⅡ,在遺傳關(guān)系上與 FJFZ、Paderborn、CSF0283、GXWZ02、GXBH、HeNXH等毒株親緣性較近,而與GenogroupⅠ中的毒株Shimen、HCLV的關(guān)系相距較遠(yuǎn)。
E0蛋白中存在2個(gè)具有Rnase活性的氨基酸基序SLHGIWPE和EWNKHWC,在廣西6株流行毒株的氨基酸序列中分別位于9-16位和56-63位(圖4)。由圖4可知,這兩個(gè)活性區(qū)域內(nèi)除了HCLV在16位上由E→G,其他氨基酸均沒有任何變異。
廣西流行野毒株的E0基因上共有6個(gè)糖基化位點(diǎn),分別在7、46、76、81、124、139位上,與Paderborn株、GXWZ02株相同,而HCLV株的E0基因上缺少了81位糖基化位點(diǎn),標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Shimen缺少了7和81位糖基化位點(diǎn)(表2)。
圖4 廣西CSFV流行毒株與參考毒株E0 2個(gè)Rnase活性區(qū)域氨基酸基序的比較Fig.4 Comparison of deduced amino acid sequences of two domains of Rnase activity among reference strains and Guangxi strain
表2 糖基化位點(diǎn)的比較Table 2 Comparison of glycosylation sites
隨著科學(xué)的進(jìn)步和科技的發(fā)展,豬瘟病毒在國內(nèi)的傳播和擴(kuò)散已經(jīng)找到了較為系統(tǒng)的防控方法,但是,某些地區(qū)的豬瘟病毒還是存在著以隱性感染的形式傳播擴(kuò)散。本文研究的6株陽性毒株發(fā)病急,病程短,病死率高達(dá)50%,25d~30d階段都已注射過豬瘟疫苗。序列分析結(jié)果表明,廣西流行株與 HCLV、Shimen、Paderborn、GXWZ02株之間核苷酸的同源性分別為80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%,廣西流行株與HCLV株、Shimen株相比同源性較低,表明廣西近期流行的CSFV與兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對照株之間存在較大的差異;相對而言,與Paderborn株、GXWZ02株親緣關(guān)系比較近。遺傳進(jìn)化樹結(jié)果表明,廣西流行毒株與疫苗株HCLV、Shimen株關(guān)系較遠(yuǎn),而與Paderborn株、GXWZ02株較為相近。說明廣西CSFV野毒株正向著遠(yuǎn)離疫苗株的方向發(fā)展,這可能也是注射了豬瘟疫苗以后未能得到免疫保護(hù),導(dǎo)致不完全免疫甚至免疫失敗的原因。
目前,關(guān)于CSFV的分子流行病學(xué)調(diào)查主要是通過對其全基因或某個(gè)特定的區(qū)域(如E0基因)進(jìn)行序列測定,分析其核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列的變異,然后構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹,追溯病毒的起源,這對CSFV的遺傳變異的研究及對其的防治有著重要意義。CSFV的E0蛋白是一種保護(hù)性抗原,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體[6],從而獲得對CSFV的免疫力。其RNase活性可能對病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染有直接關(guān)系[7],而且在病毒復(fù)制過程中有可能發(fā)揮了重要作用。E0蛋白中存在2個(gè)具有RNase活性的氨基酸基序SLHGIWPE和EWNKHWC,在廣西6株流行毒株的氨基酸序列中分別位于第9位-16位和第56位-63位,這兩個(gè)活性區(qū)域內(nèi)除了HCLV在第16位上由E→G,其他氨基酸均沒有任何變異,HCLV在第16位上的氨基酸變異有可能是導(dǎo)致廣西流行毒株未被兔化弱毒苗免疫保護(hù)的原因,具體原因還需進(jìn)一步的研究。廣西流行株GX1-GX6的E0基因上共有6個(gè)糖基化位點(diǎn),分別在第7、46、76、81、124、139 位 上,與 Paderborn 株、GXWZ02株相同,而HCLV株的E0基因上缺少了第81位糖基化位點(diǎn),標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Shimen株缺少了第7和81位糖基化位點(diǎn),這些變異有可能導(dǎo)致了抗原性差異,從而使廣西流行毒株逃脫兔化弱毒株的免疫保護(hù),導(dǎo)致不完全免疫或活免疫失敗。豬瘟病毒僅一個(gè)血清型,我國傳統(tǒng)疫苗株被證明是十分可靠且有效的疫苗,但是病毒的變異與疫苗保護(hù)的背離最終是否會導(dǎo)致疫苗不能保護(hù)未來的病毒變異株是個(gè)非常值得探討的問題。
通過對廣西豬瘟病毒流行株與4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株E0基因的序列及推導(dǎo)蛋白的分析可知,廣西CSFV流行株E0基因的抗原性發(fā)生了改變,CSFV野毒株正向著遠(yuǎn)離疫苗株的方向發(fā)展,這為今后研究豬瘟病毒與疫苗株的差異和變異規(guī)律提供理論依據(jù),也為進(jìn)一步探討E0蛋白抗原結(jié)構(gòu)提供了依據(jù)。
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