錢晶晶 遲德富 丁俊男

摘要 [目的]探索高致病白僵菌受自然環(huán)境影響條件下的生物學(xué)特性。[方法]研究外部環(huán)境條件對(duì)球孢白僵菌Bb01生長(zhǎng)的影響及對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲致病力的影響。[結(jié)果]球孢白僵菌Bb01菌株的最適培養(yǎng)基為改良馬丁氏培養(yǎng)基，菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最優(yōu)培養(yǎng)溫度為26 ℃，最佳濕度為100%，菌落的生長(zhǎng)和孢子產(chǎn)量隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)而減少；球孢白僵菌Bb01對(duì)青楊脊虎天牛成蟲的致病力不高，僅為16.67%；26～28 ℃條件下對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲的致病力最大，致死中時(shí)（LT50）分別為2.23和2.58 d，濕度在100%時(shí)致病力最大，LT50為2.57 d；通過蟲體傳代白僵菌可增強(qiáng)菌株的致病力。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為提高病原真菌的適應(yīng)性和生產(chǎn)實(shí)踐提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 球孢白僵菌；青楊脊虎天牛；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S763.304.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）27-374-06

Biological Characteristics of Beauveria bassiana Bb01 Strain

QIAN Jing-jing， CHI De-fu， DING Jun-nan*

（Northeast Forest University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to biological characteristics of B.bassiana Bb01 strain under different culture conditions. [Method] Effects of external environment conditions on the growth of B. bassiana Bb01 strain and pathogenicity to Xylotrechus rusticus L. were studied. [Result] The improved Martins medium was suitable for the growth of Bb01 strain in B. bassiana. The best temperature and humidity for spores growth and production were 26 ℃ and 100%. The growth and production of spores were decreased with the extension of UV exposure. The virulence of Bb01 strain to X. rusticus adult was low， only 16.67%. The highest virulence to X. rusticus larvae appeared under 26 ℃ and 28 ℃， the LT50 values were 2.23 d and 2.58 d， respectively. On the other hand， Bb01 strain showed the highest virulence to X. rusticus larvae at relative humidity 100% and LT50 was 2.57 d. Strain virulence could be increased by spread of X. rusticus larvae. [Conclusion] The results provide theoretical basis for improving adaptation of pathogenic fungi.

Key words Beauveria bassiana； Xylotrechus rusticus L.； Biological characteristics

白僵菌作為重要的微生物防治手段，在我國(guó)已基本上具備工業(yè)化生產(chǎn)條件，白僵菌入侵寄主體內(nèi)或者在寄主體表形成孢子時(shí)，都需要適宜孢子成長(zhǎng)的溫度和高濕條件。白僵菌具有寄主專化性，致病力主要受菌株的感染能力、對(duì)蟲體和蟲態(tài)的適應(yīng)能力和自然因素變化等條件制約[1]。東北三省是青楊脊虎天牛的主要危害區(qū)，該蟲呈逐漸嚴(yán)重趨勢(shì)，傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥防治雖能起到一定效果，但同樣污染周邊生態(tài)環(huán)境，因此，尋找一種可持續(xù)、無(wú)公害的防治方法已成為現(xiàn)在學(xué)者的研究重點(diǎn)。白僵菌的寄生性十分廣泛，但長(zhǎng)期寄生在同一宿主上就會(huì)產(chǎn)生喜嗜性，通過對(duì)白僵菌進(jìn)行定向培養(yǎng)可提高對(duì)某一昆蟲的致病力和專一性，從而有效增加防治效果。球孢白僵菌是重要的生物防治病原真菌之一，目前被廣泛應(yīng)用到林業(yè)和農(nóng)業(yè)害蟲防治實(shí)踐中。自然環(huán)境中白僵菌對(duì)害蟲的侵染受立地條件（溫度、濕度、光照、風(fēng)雨等）等因素的制約[2-3]，了解環(huán)境因素及其對(duì)白僵菌致病力的影響具有生產(chǎn)實(shí)踐意義。目前關(guān)于環(huán)境因素對(duì)白僵菌侵染青楊脊虎天牛影響的研究尚未見報(bào)道。

鑒于此，筆者前期從多種白僵菌中篩選出對(duì)青楊脊虎天牛具有高毒力的球孢白僵菌菌株Bb01，研究了外部環(huán)境條件影響白僵菌的生長(zhǎng)因素和對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲致病力的影響，以期為提高病原真菌的適應(yīng)性和生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

試驗(yàn)于2014年5～7月在東北林業(yè)大學(xué)森林病蟲害生物學(xué)國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試菌種為從青楊脊虎天牛上采集的球孢白僵菌Bb01菌株，將菌株培養(yǎng)在試管PDA斜面培養(yǎng)基上10 d后備用。

1.1.2 植物材料與藥劑。

馬鈴薯為市售；瓊脂、硫酸鐵、硫酸鎂和蛋白胨購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鈉購(gòu)自上海之臻化工有限公司；蔗糖購(gòu)自天津市博迪化工股份有限公司；葡萄糖和酵母膏購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；麥芽糖購(gòu)自廣東省廣州市酷泰貿(mào)易有限公司；磷酸氫二鉀購(gòu)自河北省廊坊天科生物有限公司；氯化鉀購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)；硫胺素購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，藥品均為分析純。

1.1.3 儀器。

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療儀器廠）、XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、PH070A型恒溫培養(yǎng)箱（上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、HDL型無(wú)菌操作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司）。

1.1.4 供試培養(yǎng)基。

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（Martin）：馬鈴薯汁1 000 ml、葡萄糖20.00 g、KH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、硫胺素8 mg、瓊脂20.00 g。

察氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek）：NaNO3 3.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂15.00 g、蒸餾水1 000 ml；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯汁1 000 ml、葡萄糖20.00 g、瓊脂20.00 g；

馬鈴薯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（PPDA）：馬鈴薯汁1 000 ml、蛋白胨10.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂20.00 g；

薩氏葡萄糖酵母瓊脂培養(yǎng)基（SDAY）：蛋白胨10.00 g、葡萄糖40.00 g，酵母膏2.00 g、瓊脂20.00 g、蒸餾水1 000 ml；

薩氏麥芽糖酵母瓊脂培養(yǎng)基（SMAY）：蛋白胨10.00 g、麥芽糖40.00 g、酵母膏2.00 g、瓊脂20.00 g、蒸餾水1 000 ml。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)Bb01菌株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的影響。

選用Martin、PDA、PPDA、Czapek、SDAY和SMAY 6種配方配制平板培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基均在高溫（121 ℃蒸汽）、高壓（0.1 MPa）下滅菌20 min。無(wú)菌條件下用刮鏟刮取球孢白僵菌菌株Bb01孢子，置于各培養(yǎng)基中心位置上（培養(yǎng)皿直徑為90 mm），封口膜密封后置于恒溫培養(yǎng)箱（26 ℃、相對(duì)濕度大于85%、無(wú)光照）中培養(yǎng)10 d，每天觀察生長(zhǎng)情況并測(cè)量記錄菌落直徑，每個(gè)處理5次重復(fù)，篩選最適培養(yǎng)基質(zhì)。

1.2.2 溫度對(duì)Bb01菌株生長(zhǎng)的影響。

參照潘志平等[3]的方法并略作修改，參照“1.2.1”方法接種。將球孢白僵菌Bb01菌株接種于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)在不同溫度環(huán)境下，設(shè)定恒溫培養(yǎng)箱為14、20、26、28和32 ℃，相對(duì)濕度大于85%、無(wú)光照培養(yǎng)10 d，每2 d測(cè)定菌落直徑并記錄，每個(gè)處理5次重復(fù)。10 d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量，取培養(yǎng)皿中心位置約5 mm的菌塊，放入0.1%吐溫-80無(wú)菌水中，漩渦振蕩后配成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定計(jì)算產(chǎn)孢量，每處理3次重復(fù)。

孢子數(shù)的計(jì)算方法：

1 cm2菌落孢子量=（平均每小格孢子量×4×106×稀釋倍數(shù)）/（3.14×0.16）

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年

1.2.3 濕度對(duì)Bb01菌落生長(zhǎng)的影響。

參照王寶輝[4]的方法并略作修改，參照“1.2.1”方法接種。將球孢白僵菌Bb01菌株置于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，設(shè)定恒溫培養(yǎng)箱濕度為100%、85%、75%和65%，溫度為26 ℃，無(wú)光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每2 d測(cè)量菌落直徑并記錄，每個(gè)處理5次重復(fù)。產(chǎn)孢量測(cè)定方法參照方法“1.2.2”。

1.2.4 紫外照射對(duì)Bb01菌落生長(zhǎng)的影響。

參照盧振起[5]的方法并略作修改，菌株接種方法參照“1.2.1”。將球孢白僵菌Bb01菌株置于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在超凈工作臺(tái)內(nèi)距30 W紫外線燈50 cm下照射15、30、45、60、75、90和120 min后放入恒溫培養(yǎng)箱（26 ℃，相對(duì)濕度大于85%，無(wú)光照）培養(yǎng)10 d，以正常培養(yǎng)不照紫外線作為對(duì)照（CK），每2 d觀察白僵菌菌落生長(zhǎng)情況并記錄，每個(gè)處理5次重復(fù)。產(chǎn)孢量計(jì)算參照方法“1.2.2”。

1.2.5 球孢白僵菌Bb01對(duì)青楊脊虎天牛成蟲的侵染。

選取體態(tài)健康完整、行為活躍的青楊脊虎天牛成蟲，用無(wú)菌水清洗體表，噴灑3 ml配制好的孢子懸浮液在1～10 d日齡青楊脊虎天牛成蟲體后放入養(yǎng)蟲籠中，每籠不分雌雄隨機(jī)放入6頭成蟲，在養(yǎng)蟲籠中放入新鮮楊樹枝條并每日更換，保持水分，試驗(yàn)共5個(gè)重復(fù)，每日觀察感染情況并記錄死亡情況，將死蟲收集保濕處理保存在人工培養(yǎng)箱[26 ℃、相對(duì)濕度為（75±10）%、無(wú)光照]中，鏡檢觀察死蟲體表是否有菌絲附著以確定為白僵菌感染致死，無(wú)菌絲附著則確定為非白僵菌致死。另設(shè)用0.1%吐溫-80無(wú)菌水噴灑在成蟲身上作為對(duì)照處理，共隨機(jī)處理10頭成蟲。

1.2.6 溫度對(duì)球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影響。

采用“孢子浴”法，選取齡期一致、體態(tài)健康的青楊脊虎天牛幼蟲浸入配制好的孢子懸浮液中30 s后放入無(wú)菌養(yǎng)蟲盒（放置含水無(wú)菌脫脂棉球以保持水分）中，放入不同溫度環(huán)境下，設(shè)定恒溫培養(yǎng)箱為14、20、26、28和32 ℃[相對(duì)濕度為（75±10）%、無(wú)光照]，每個(gè)溫度處理15頭幼蟲。每天觀察白僵菌感染和死亡情況，蟲尸保濕處理在人工培養(yǎng)箱[26 ℃、相對(duì)濕度為（75±10）%和無(wú)光照]中，并在鏡檢下確定是否為球孢白僵菌感染，記錄并計(jì)算死亡率和LT50。

死亡率=（處理蟲數(shù)-活蟲數(shù)）/處理蟲數(shù)×100%

1.2.7 濕度對(duì)球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影響。

侵染參照“1.2.6”方法，將齡期一致的青楊脊虎天牛幼蟲浸入濃度為1×108個(gè)/ml的孢子懸浮液中45 s后放入無(wú)菌養(yǎng)蟲盒（不放飼料）中，然后將養(yǎng)蟲盒放入人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，將人工培養(yǎng)箱（28 ℃、無(wú)光照）設(shè)置4個(gè)不同濕度梯度（100%、90%、80%和70%），每日觀察幼蟲的死亡情況并記錄，每個(gè)處理15頭幼蟲，3次重復(fù)，收集蟲尸保濕處理培養(yǎng)在人工培養(yǎng)箱[26 ℃、相對(duì)濕度為（75±10）%、無(wú)光照]中，并在鏡檢下確定是否為球孢白僵菌感染，統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡率和LT50。

1.2.8 菌株傳代方式對(duì)侵染力的影響。

將原始菌株作為初始一代S1，將S1代用0.1%吐溫-80無(wú)菌水配制成濃度為1×108個(gè)/ml的孢子懸浮液，對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲進(jìn)行侵染試驗(yàn)，從感染蟲體上取孢子并培養(yǎng)在改良馬丁氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)產(chǎn)生的分生孢子定義為F1代，并制成濃度為1×108個(gè)/ml的孢子懸浮液繼續(xù)對(duì)幼蟲進(jìn)行侵染試驗(yàn)，并取蟲體感染孢子培養(yǎng)得F2代，以該方法類推取得F3代，每代供試15頭青楊脊虎天牛幼蟲，每個(gè)處理3次重復(fù)。

將S1代培養(yǎng)在改良馬丁氏培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)15 d后取其孢子培養(yǎng)在改良馬丁氏培養(yǎng)基上并定義為S2代，依該方法類推取得S3代，將各代培養(yǎng)的菌株配成濃度為1×108個(gè)/ml的孢子懸浮液，每代供試15頭青楊脊虎天牛幼蟲，將幼蟲浸在孢子液中40 s后放在無(wú)菌養(yǎng)蟲盒中，每個(gè)處理3次重復(fù)，共處理10 d。置于恒溫培養(yǎng)箱中，每天觀察其死亡情況并記錄，計(jì)算死亡率和LT50。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理。采用DPS和Excel軟件處理數(shù)據(jù)，使用時(shí)間-劑量死亡率分析模型LT50和致死中濃度（LC50）以及95%置信區(qū)間；采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncans新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 由表1可知，改良馬丁氏培養(yǎng)基在培養(yǎng)10 d后的菌落直徑最大，為5.70 cm，顯著大于其他培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)初期，PPDA的菌落直徑明顯大于其他5種基質(zhì)，第4天改良馬丁培養(yǎng)基的直徑開始迅速增大，從培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看其菌落生長(zhǎng)時(shí)緊密、肥厚，具有良好的營(yíng)養(yǎng)條件，產(chǎn)孢量為5.13×108個(gè)/ml。因此，可以認(rèn)為改良馬丁氏培養(yǎng)基最適合Bb01菌株的生長(zhǎng)。溫度、濕度和紫外照射條件影響下的菌株生物學(xué)特性試驗(yàn)均采用該培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)情況的影響

由表2和圖1可知，在

14～32 ℃條件下Bb01菌株均能生長(zhǎng)，但不同溫度下生長(zhǎng)情

況各不相同。其中，26～28 ℃最適宜菌落生長(zhǎng)，10 d后菌落直徑分別達(dá)到6.14和6.10 cm，顯著高于其他溫度下的生長(zhǎng)情況，菌落生長(zhǎng)與溫度具有良好的線性關(guān)系（R2=0.99）；14 ℃下菌落直徑僅為1.86 cm，可見，相對(duì)低溫不利于球孢白僵菌Bb01菌落的生長(zhǎng)。

注：各個(gè)時(shí)間點(diǎn)柱上不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

圖1 溫度對(duì)球孢白僵菌Bb01菌落生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量影響具有顯著差異，菌株產(chǎn)孢量與菌落直徑呈正相關(guān)，溫度在28 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，14 ℃低溫既利于菌落的生長(zhǎng)又不利于孢子的生產(chǎn)，而高溫也不利于孢子的產(chǎn)生，球孢白僵菌Bb01的最佳產(chǎn)孢溫度為26～28 ℃。

2.3 濕度對(duì)菌落生長(zhǎng)情況的影響

由圖2可知，菌落直徑隨著濕度的增加而增大，各濕度培養(yǎng)條件下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)菌落直徑呈現(xiàn)出逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)；生長(zhǎng)初期相對(duì)濕度為100%和85%時(shí)生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯差異，但都高于同期的75%和65%處理組。當(dāng)相對(duì)濕度為100%時(shí)菌落直徑生長(zhǎng)最快，生長(zhǎng)10 d后菌落直徑達(dá)到6.47 cm，而相對(duì)濕度為65%時(shí)菌落直徑最小，生長(zhǎng)10 d后菌落直徑達(dá)到5.31 cm，僅為最高濕度處理的82.07%。

注：各個(gè)時(shí)間點(diǎn)柱上不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

圖2 濕度對(duì)球孢白僵菌Bb01菌株生長(zhǎng)的影響

由表3可知，相對(duì)濕度對(duì)菌落產(chǎn)孢量具有顯著影響，相對(duì)濕度為100%時(shí)產(chǎn)孢量最大，且產(chǎn)孢量隨著濕度的降低而降低，相對(duì)濕度為75%時(shí)10 d產(chǎn)孢量?jī)H為濕度為100%的0.64倍。菌落生長(zhǎng)與濕度具有良好的線性關(guān)系（R2=0.95）。

2.4 紫外線照射對(duì)菌落生長(zhǎng)情況的影響

由圖3可知，紫外線對(duì)球孢白僵菌Bb01菌株生長(zhǎng)有明顯抑制作用，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)孢子基數(shù)變小。紫外照射120 min培養(yǎng)10 d后的菌落直徑為2.20 cm，平均僅為對(duì)照的38.57%，長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射不利于球孢白僵菌孢子的活力，從而影響菌落的生長(zhǎng)。紫外線照射處理長(zhǎng)時(shí)間（75～120 min）內(nèi)差異不顯著，處理短時(shí)間內(nèi)差異極顯著?？梢?，紫外照射超過75 min以上對(duì)菌落生長(zhǎng)影響不大，而短時(shí)紫外線照射對(duì)菌落生長(zhǎng)影響較大。

注：各個(gè)時(shí)間點(diǎn)柱上不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

圖3 紫外線照射對(duì)球孢白僵菌Bb01菌株生長(zhǎng)的影響

由表4可知，球孢白僵菌Bb01菌株的產(chǎn)孢量隨紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少，可見紫外線照射對(duì)白僵菌的產(chǎn)孢量具有明顯的抑制作用；對(duì)照組與紫外線照射處理15 min的產(chǎn)孢量無(wú)明顯差異，與紫外線處理30 min以上產(chǎn)孢量差異極顯著；紫外線照射時(shí)間與菌落生長(zhǎng)均具有良好的線性關(guān)系（R2>0.90）。

2.5 青楊脊虎天牛成蟲被球孢白僵菌侵染后外部特征

由圖4可知，白僵菌對(duì)青楊脊虎天牛成蟲具有一定侵染能力，

侵染初期，成蟲活動(dòng)狀態(tài)與正常成蟲并無(wú)區(qū)別，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)感染成蟲活動(dòng)減緩、不活躍，只附在枝條或防蟲網(wǎng)上，隨后死亡。白僵菌對(duì)蟲體侵染部位具有選擇性，由于成蟲外表堅(jiān)固、組織緊密，白僵菌侵染部位主要為胸部節(jié)間處、翅膀下部和腹部體壁薄弱部位。

2.6 球孢白僵菌Bb01對(duì)青楊脊虎天牛成蟲的侵染力 由表5可知，球孢白僵菌Bb01對(duì)青楊脊虎天牛成蟲具有侵染能力，但侵染率不高，僅為16.67%。

表5 球孢白僵菌Bb01對(duì)青楊脊虎天牛成蟲的侵染

處理處理數(shù)∥頭侵染數(shù)∥頭侵染率∥%

Bb0130516.67

CK1000

2.7 溫度對(duì)球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影響

由表6可知，溫度對(duì)菌株的侵染能力具有明顯影響，各溫度間對(duì)幼蟲的累計(jì)死亡率各不相同，28 ℃處理第2天已有幼蟲感染死亡，第4天20和26 ℃相繼出現(xiàn)死亡情況，26 ℃處理第8天供試幼蟲已全部死亡，直到第10天28 ℃處理幼蟲也全部死亡，低溫（14 ℃）下幼蟲累計(jì)死亡率最小，試驗(yàn)期達(dá)到26.67%，而高溫（32 ℃）下累計(jì)死亡率達(dá)到48.89%，低溫和高溫均不利于白僵菌對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲的致病力。26 ℃ LT50用時(shí)最短，只有2.23 d，明顯低于其他溫度處理LT50，其次是28 ℃處理LT50為2.58 d?？梢?，26～28 ℃下球孢白僵菌Bb01菌株對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲的致病力最強(qiáng)。

2.8 濕度對(duì)球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影響

由表7可知，球孢白僵菌菌株對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲的侵染能力隨著相對(duì)濕度的降低而降低，相對(duì)濕度100%處理時(shí)侵染力最大，第8天感染幼蟲已全部死亡，LT50為2.57 d；相對(duì)濕度為90%時(shí)的侵染力僅次于100%處理，供試期內(nèi)幼蟲全部死亡，LT50為2.83 d?？梢?，球孢白僵菌Bb01菌株在相對(duì)濕度為100%～90%時(shí)對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲的侵染力最強(qiáng)。

2.9 傳代方式對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲侵染力的影響

由表8可知，不同傳代方式對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲的累計(jì)死亡率有明顯影響，通過感染寄主所培養(yǎng)的菌株侵染力逐代增強(qiáng)，F(xiàn)1～F3代均表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，其中F3代致病力最強(qiáng)在第8天時(shí)，供試幼蟲已全部死亡，LT50值最小，僅為1.81 d，顯著低于其他處理；通過培養(yǎng)基傳代后的累計(jì)死亡率隨著傳代越多致病力越弱，LT50用時(shí)越長(zhǎng)，S1～S3代雖然也表現(xiàn)出良好的致病力，但各代致病力明顯低于F3代，S3代第4天累計(jì)死亡率僅為6.67%，僅為F3代的0.21倍，第10天S2和S3代累計(jì)死亡率分別為88.89%和84.45%，S3代LT50值最大，為2.64 d。

表

3 討論

目前白僵菌的培養(yǎng)主要采用PDA、SDAY和Czapek培養(yǎng)基[5-6]，該研究采用6種不同基質(zhì)的培養(yǎng)基，結(jié)果表明在改良馬丁氏培養(yǎng)基上一定時(shí)間內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)最快，且菌落生長(zhǎng)厚實(shí)、緊密，培養(yǎng)條件最適宜，培養(yǎng)Bb01菌株應(yīng)首選改良馬丁氏培養(yǎng)基。相關(guān)研究表明，球孢白僵菌在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)可不同程度地利用單糖、雙糖和多糖等碳源和氮源，球孢白僵菌以蛋白質(zhì)和白砂糖為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)菌絲生長(zhǎng)迅速，而菌絲對(duì)甘露醇和硫酸銨為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)生長(zhǎng)則較慢[7-8]?？梢?，不同成分的培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)快慢具有決定作用，適宜的培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)環(huán)境會(huì)促進(jìn)菌絲的快速生長(zhǎng)。

相關(guān)研究表明，不同溫度條件下白僵菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和對(duì)害蟲的致病性表現(xiàn)各不相同[8]，該試驗(yàn)結(jié)果表明，球孢白僵菌Bb01菌株最適的生長(zhǎng)溫度為26～28 ℃，同時(shí)也是最佳的產(chǎn)孢溫度，溫度過低和過高菌株均不能快速生長(zhǎng)和有效產(chǎn)孢。徐艷聆等[9]研究表明14～32 ℃溫度下白僵菌均能進(jìn)行生長(zhǎng)，并在26 ℃下生長(zhǎng)最優(yōu)，與該研究結(jié)果相一致。不同溫度下對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲進(jìn)行侵染結(jié)果表明，溫度可直接影響球孢白僵菌Bb01菌株的致病力。當(dāng)溫度過低或過高時(shí)，菌株的致病力都不高，與不同溫度下白僵菌生長(zhǎng)量和孢子產(chǎn)量相吻合，溫度為26 ℃時(shí)，白僵菌對(duì)幼蟲侵染能力最強(qiáng)，且出現(xiàn)較早致死的現(xiàn)象，在8 d時(shí)累積死亡率達(dá)到100%，28 ℃處理也表現(xiàn)良好的侵染和致病效果。致死效果明顯高于14、20和32 ℃處理效果。溫度是菌落生長(zhǎng)以及孢子生產(chǎn)和萌發(fā)的主要因素，而孢子侵染是白僵菌致病的主要途徑[10]。球孢白僵菌可在較寬的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，谷祖敏等[11]研究表明22～26 ℃下球孢白僵菌對(duì)蚜蟲有較強(qiáng)的侵染力，致死時(shí)間出現(xiàn)也最早，在26 ℃下5 d時(shí)的累計(jì)死亡率為100%，溫度上升到30 ℃后死亡率隨之下降，僅為90%，可見，高溫直接影響孢子萌發(fā)從而影響致病力。溫度降低能阻礙孢子的萌發(fā)，從而延長(zhǎng)白僵菌的侵染和致死時(shí)間[12]?；诒狈綒夂虻奶攸c(diǎn)，球孢白僵菌Bb01的施用理論上應(yīng)選擇春末夏初時(shí)的青楊脊虎天牛幼蟲期為宜，但林間施用影響因素較多（如風(fēng)、溫濕度和光照等），對(duì)具體應(yīng)用以及對(duì)青楊脊虎天牛蛹期的效果還有待進(jìn)一步探索。

戴君惕認(rèn)為濕度是能夠直接影響球孢白僵菌菌絲生長(zhǎng)的重要因素之一[13]，當(dāng)相對(duì)濕度低于55%時(shí)菌絲基本不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)很慢，隨著濕度的升高菌絲的生長(zhǎng)逐漸加快[14]。該研究中，隨著相對(duì)濕度的逐漸降低菌株的生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量逐漸降低，相對(duì)濕度為100%時(shí)菌落直徑達(dá)到6.47 cm，孢子量為7.11×108個(gè)/ml，孢子在適宜的濕度條件下才能夠萌發(fā)，研究菌株濕度的生物學(xué)特性可為生產(chǎn)上將球孢白僵菌制成可濕性粉劑等生物殺蟲劑提供理論依據(jù)。濕度同樣也是影響白僵菌致病力的重要因素之一，菌絲需要適宜的濕度才能形成分生孢子，而在蟲體上的附著時(shí)間同樣受到濕度的制約。該研究表明，濕度越高球孢白僵菌對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲的累計(jì)死亡率越高且用時(shí)越短，試驗(yàn)采用孢子浴法對(duì)試蟲進(jìn)行侵染，前期試驗(yàn)結(jié)果表明濕度越大產(chǎn)孢量也越大，所以濕度影響孢子的產(chǎn)出和萌發(fā)從而影響白僵菌的侵染力。孫魯娟等[15]研究表明濕度在95%時(shí)侵染力最大，濕度降到70%以下時(shí)侵染力明顯降低。室內(nèi)試驗(yàn)?zāi)芎芎玫乜刂茲穸?，但在林間施用應(yīng)盡量選擇空氣濕度較大的陰天或雨天。

紫外線具有滅菌、抑菌的作用，實(shí)驗(yàn)室常用來(lái)殺菌準(zhǔn)備工作。該研究采用不同紫外照射時(shí)間對(duì)球孢白僵菌Bb01生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果表明長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射能夠明顯抑制供試球孢白僵菌菌落的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量，生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。在自然環(huán)境中，白僵菌極易受到紫外線的照射造成生產(chǎn)力的下降或變異，形成不穩(wěn)定的性狀，紫外線的照射主要會(huì)造成球孢白僵菌內(nèi)DNA分子結(jié)構(gòu)的損壞，由于胸腺嘧啶二聚體的產(chǎn)生會(huì)造成DNA復(fù)制受阻，細(xì)胞最終死亡[10]。為了防止紫外線的侵害，資料顯示可在生產(chǎn)實(shí)踐中加入抗壞血酸等化學(xué)保護(hù)劑來(lái)起到防護(hù)作用[15]。

白僵菌感染昆蟲需要適宜的自然環(huán)境，如利于孢子萌發(fā)的溫度、濕度和紫外照射等條件，白僵菌致病力的強(qiáng)弱同樣受到當(dāng)時(shí)立地環(huán)境的制約（溫、濕、光、雨和風(fēng)等）[16]，研究自然因素影響白僵菌對(duì)青楊脊虎天牛的致病力，對(duì)于野外實(shí)際防治青楊脊虎天牛具有理論指導(dǎo)意義。

完全變態(tài)昆蟲發(fā)育經(jīng)過受精卵-幼蟲-蛹-成蟲4個(gè)階段。目前，采用病原真菌對(duì)有害昆蟲的防治多對(duì)其幼蟲狀態(tài)進(jìn)行。該研究采用青楊脊虎天牛幼蟲高毒力菌株球孢白僵菌Bb01對(duì)成蟲進(jìn)行侵染，結(jié)果表明菌株對(duì)成蟲具有侵染力，但侵染效果只有16.67%，從死蟲蟲體上觀察主要侵染部位為胸部的節(jié)間處、翅膀下部和腹部體壁薄弱部位。有研究表明球孢白僵菌Bb202-1菌株對(duì)松褐天牛成蟲具有較高的殺蟲活性，統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡率為88%，這種侵染差異結(jié)果主要是由白僵菌菌種的寄主專一性和種間差異所造成的[17]。而研究不同侵染部位，結(jié)果表明成蟲足與腹部為主要感染部位，與該研究結(jié)果基本相同。李會(huì)平等[18]研究表明白僵菌對(duì)桑天牛蟲卵不能進(jìn)行侵染，對(duì)孵化的幼蟲和成蟲也無(wú)影響，對(duì)成蟲具有一定的侵染力。由于青楊脊虎天牛獨(dú)特的生物學(xué)特性，幼蟲生長(zhǎng)期基本都隱蔽在樹干中，而只有羽化期才暴露在樹干外進(jìn)行繁殖，該時(shí)期對(duì)青楊脊虎天牛防治具有重要意義，如何采取無(wú)公害、高毒力的病原真菌對(duì)青楊脊虎天牛成蟲進(jìn)行防治有待進(jìn)一步研究。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，菌種的繼代培養(yǎng)常表現(xiàn)出產(chǎn)孢量降低、致病毒力減退等現(xiàn)象，如何對(duì)白僵菌進(jìn)行有效的定向培養(yǎng)以及菌株復(fù)壯后的良好致病力成為菌種培養(yǎng)的一個(gè)方向。該試驗(yàn)選用球孢白僵菌培養(yǎng)基繼代和蟲體繼代2種方式對(duì)青楊脊虎天牛幼蟲侵染力進(jìn)行比較，結(jié)果表明培養(yǎng)基繼代后菌株對(duì)寄主侵染能力減弱，蟲體繼代后菌株對(duì)寄主侵染能力增強(qiáng)，與前人試驗(yàn)結(jié)果一致[19-20]。菌株繼代培養(yǎng)后侵染能力的變化是受自身遺傳物質(zhì)控制的，隨著傳代的繼續(xù)菌株內(nèi)基因組DNA發(fā)生明顯變化，傳代越多產(chǎn)孢量越低[21]，培養(yǎng)環(huán)境的改變促使不同基因型核比例的改變，傳統(tǒng)培養(yǎng)的方式會(huì)使以異核形式存在的白僵菌體內(nèi)異核比例發(fā)生變化[22]。相關(guān)研究表明病原真菌的孢外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性與侵染力有關(guān)[23-25]，培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后繼代越多產(chǎn)酶水平越小，對(duì)害蟲的致死中時(shí)越長(zhǎng)；而蟲體培養(yǎng)上繼代越多產(chǎn)酶水平越高，致死中時(shí)越短，這可能是由于寄主表皮成分中含有能夠誘導(dǎo)水解酶產(chǎn)生的特殊物質(zhì)所致[18，26]。樊美珍等[27]認(rèn)為增加動(dòng)物性氮源比植物性氮源更能夠促進(jìn)白僵菌菌落格局的穩(wěn)定性；動(dòng)物性氮源可以有效增強(qiáng)菌落的產(chǎn)孢量和致病力[28]。白僵菌實(shí)際生產(chǎn)中要人為有效地控制菌株退化變異，選取優(yōu)良菌株并進(jìn)行培養(yǎng)改良，合理的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)成分可

以增強(qiáng)白僵菌菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量從而為高致病性做物質(zhì)準(zhǔn)備。建議在以后的實(shí)踐中選用適合青楊脊虎天牛高毒力菌株的培養(yǎng)基中加入動(dòng)物性氮源（如蟲尸粉等）以保持菌株的生產(chǎn)活力，減小變異性。隨著蟲體傳代的繼續(xù)，多代后高侵染力依然能夠保持有待進(jìn)一步研究。

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