邵玲軒　劉源　吳海云　席溫新　戎凱云

摘 要：電化學(xué)免疫傳感器具有選擇性好、靈敏度高、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，但由于諸多因素影響著它的正常使用和推廣。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，電極材料的選擇、修飾方法和固定化技術(shù)使用等是影響其性能的主要因素之一。其次，采用的檢測(cè)方法，信號(hào)的采集電路的設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)處理方法對(duì)其精度和穩(wěn)定性也有很大的影響。此外，測(cè)試環(huán)境參數(shù)的設(shè)置如待測(cè)溶液的pH值、響應(yīng)時(shí)間，激勵(lì)信號(hào)的選擇，電壓范圍的設(shè)置等因素都影響著電化學(xué)免疫傳感器的性能。

關(guān)鍵詞：免疫傳感器；電化學(xué)；影響性能因素

引言

隨著科技的發(fā)展，環(huán)境污染越來越嚴(yán)重，破壞了生態(tài)環(huán)境。為了實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)水質(zhì)中的污染物，以便達(dá)到快速治理，常采用電化學(xué)免疫傳感器。免疫傳感器具有多樣性、響應(yīng)時(shí)間短，使用壽命長(zhǎng)，靈敏度高、可重復(fù)使用等特點(diǎn)，適用于便攜式、在線檢測(cè)和遠(yuǎn)程監(jiān)控，已在軍事科學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)、食品檢測(cè)及環(huán)境監(jiān)測(cè)方面得到廣闊的應(yīng)用[1-3]。但是由于電化學(xué)免疫傳感器的性能不穩(wěn)定，使得該類傳感器不能產(chǎn)業(yè)化和推廣使用。文章以電流型電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)水中萘為例，對(duì)影響傳感器的性能因素進(jìn)行了初步探究。

1 電化學(xué)免疫傳感器工作原理

電化學(xué)免疫傳感器利用抗體和抗原之間的特異性的組合，改變其電化學(xué)信號(hào)，使敏感元件（抗原/抗體）固定在載體膜上，電極作為轉(zhuǎn)換元件，傳感器的反應(yīng)信號(hào)通過轉(zhuǎn)換器，再進(jìn)行放大和處理并顯示。

2 免疫電極的制備技術(shù)直接影響傳感器的性能

免疫電極是電化學(xué)免疫傳感器的核心部件，其制備通常包括電極制備和選擇、電極的化學(xué)修飾和免疫識(shí)別分子的固定等過程。電極材料的選擇、修飾方法和固定化技術(shù)的設(shè)計(jì)、操作步驟、優(yōu)劣程度、穩(wěn)定性、合理性與否對(duì)降低傳感器的成本，提高傳感器的選擇性、穩(wěn)定性和靈敏度有直接影響。

2.1 電極的制備

傳感器的電極是敏感元件，它的性能如靈敏度、選擇性受生物大分子包埋方式的影響。常見的方法有：吸附法，包埋法，電化學(xué)聚合方法，共價(jià)結(jié)合法、自組裝法和交聯(lián)的方法等。

研究采用三電極系統(tǒng)，工作電極選用鉑電極。工作電極用0.1mm直徑的鉑絲做成半球狀，將其粘接固定在一個(gè)塑料環(huán)中，然后將其疊合粘接在參比電極上，就構(gòu)成了三電極微型電解池。在使用鉑電極之前，要用酸堿反復(fù)清洗，并在0.025mol/L的氯化鉀溶液中，于0.2-0.6V電壓范圍內(nèi)，進(jìn)行循環(huán)掃描，直至電流基線穩(wěn)定為止。

2.2 電極的預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)的信號(hào)源采用型號(hào)為CHI660D的電化學(xué)工作站。為了保證實(shí)驗(yàn)中工作電極上的電場(chǎng)分布均勻和電極的重復(fù)性良好，在電極使用之前用先用蒸餾水沖洗，在用紫外光殺毒處理，最后用氮?dú)獯蹈?，電極修復(fù)前后，電極上的電流電壓圖如圖1所示。

生物識(shí)別元件的修飾是免疫傳感器研制的關(guān)鍵步驟。修飾后的生物識(shí)別分子應(yīng)保持良好的反應(yīng)活性，且其活性或親和位點(diǎn)能與目標(biāo)物結(jié)合，并能盡量降低非特異性吸附，從而提高免疫傳感器的信號(hào)響應(yīng)、靈敏度和穩(wěn)定性。

室溫下，采用電位直測(cè)定抗原濃度的方法，把酶標(biāo)記在免疫傳感器的工作電極上，浸入等濃度梯度的H2O2溶液中，裸金電極作為參比電極，然后均勻的攪拌溶液，等待幾秒之后，便可以測(cè)定電壓值，直到記錄下的電壓值達(dá)到穩(wěn)定。由于固定在免疫傳感器上的酶與溶液中對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗體分子進(jìn)行特異性結(jié)合，清洗以后，加入HRP氧化雙氧水，由此會(huì)產(chǎn)生電信號(hào)。而當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，HRP濃度與電位的差值呈正比，相應(yīng)的依附在免疫傳感器表面的那部分HRP就會(huì)氧化雙氧水，產(chǎn)生與之濃度呈正比的電位差。由于HRP這種標(biāo)記酶的存在，使得溶液中的抗體濃度與電位差值呈現(xiàn)正比，所以可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的電位差值判斷所測(cè)溶液的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膜的薄厚、均勻度好壞、重復(fù)性、修復(fù)技術(shù)等直接影響著免疫傳感器的性能。

3 信號(hào)采集與處理方式對(duì)特性的影響

3.1 采集信號(hào)的特點(diǎn)

在電化學(xué)傳感器檢測(cè)中，有時(shí)由于反應(yīng)機(jī)理、溶液濃度等原因，反應(yīng)產(chǎn)生的電流很小，可達(dá)到nA級(jí)甚至更小[4]，對(duì)微電流的采集，信號(hào)調(diào)理電路、噪聲處理電路設(shè)計(jì)及抗外界干擾方法等對(duì)傳感器的精度和穩(wěn)定性影響較大。

3.2 電極系統(tǒng)的選擇

根據(jù)待測(cè)物質(zhì)所處系統(tǒng)環(huán)境的不同，精度要求不同，可選用兩電極系統(tǒng)、三電極體系和四電極體系。如果確定輔助電極的電極電位在測(cè)試過程中不發(fā)生變化或者變化可忽略不計(jì)時(shí)，可選用兩電極體系；當(dāng)在外激勵(lì)信號(hào)的作用下，為了克服電極極化和環(huán)境波動(dòng)的影響，可利用一對(duì)外電極將激勵(lì)電流導(dǎo)入液體，并測(cè)量一對(duì)內(nèi)電極上的電壓，采用四電極系統(tǒng)。它主要采用的是交流阻抗法，測(cè)試電阻；在三電極體系中，由于電流不通過參比電極，使得輔助電極和工作電極之間的電壓比兩電極體系中工作電極和參比電極之間的電壓更穩(wěn)定，所以三電極體系是最通常的選擇。

3.3 采集系統(tǒng)影響性能因素

3.3.1 恒電位電路對(duì)傳感器特性的影響

在三電極系統(tǒng)中，恒電位電路的設(shè)計(jì)精度是保障系統(tǒng)檢測(cè)精度的主要因素之一。在氧化還原反應(yīng)的過程中，由于工作電極反應(yīng)物質(zhì)濃度的下降，系統(tǒng)穩(wěn)定性發(fā)生了改變，會(huì)影響系統(tǒng)測(cè)量。采用恒電勢(shì)電路，使用三個(gè)電極電位閉環(huán)負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)保持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，消除由于反應(yīng)時(shí)間和電極電位的影響，它解決了因反應(yīng)造成外部激勵(lì)信號(hào)值偏離以及溶液電阻Ru的存在是造成控制誤差，保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。恒電位儀是各種三電極式（工作電極、輔助電極、參比電極）電化學(xué)傳感器的接口，主要將外部激勵(lì)信號(hào)近乎準(zhǔn)確地施加于傳感器上，驅(qū)動(dòng)樣品溶液發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，并對(duì)產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)做相應(yīng)的預(yù)處理（信號(hào)轉(zhuǎn)換、放大、濾波）[5-6]。目前多選用全差分型的恒電位儀芯片。

3.3.2 信號(hào)處理電路設(shè)計(jì)對(duì)傳感器特性的影響

信號(hào)處理多采用高階低通濾波器電路、噪聲處理電路和放大電路，I/V轉(zhuǎn)換的作用是將電流信號(hào)轉(zhuǎn)換為電壓信號(hào)的裝置；低通濾波器電路是將高頻干擾信號(hào)去除，而電壓信號(hào)的干擾輸出穩(wěn)定，AD轉(zhuǎn)換器最好選用精度高，抗干擾能力強(qiáng)的芯片。

4 測(cè)試環(huán)境參數(shù)的設(shè)置對(duì)傳感器性能的影響

4.1 pH值對(duì)輸出電流的影響

溶液的pH值對(duì)免疫傳感器電位響應(yīng)有顯著的影響。在其他保持不變的情況下，實(shí)驗(yàn)研究了pH 5.5-8.5的PBS溶液對(duì)免疫傳感器電流響應(yīng)是有影響的，如表1所示。

當(dāng)pH在5.5～7.4范圍，氧化峰電流飛速減小至最小值；在pH在7.4-8.5內(nèi)，pH逐漸增大，伴隨著峰電流的逐步增大。當(dāng)pH=7.4時(shí)，抗原抗體結(jié)合產(chǎn)生的復(fù)合物緊緊地附著在免疫傳感器的電極層面上，這樣才導(dǎo)致電流值降到最小值。

4.2 測(cè)試時(shí)間對(duì)電流/電壓的影響

圖3所示的是在相同濃度下，分別在不同氧化還原反應(yīng)時(shí)間（馬上測(cè)、4分鐘、10分鐘、16分鐘、19分鐘和22分鐘），對(duì)應(yīng)的電壓值和電流值的變化。從圖中可以看出，任何一個(gè)待測(cè)濃度溶液，在外加激勵(lì)信號(hào)后，應(yīng)放在13-16分鐘，待進(jìn)行充分的氧化還原反應(yīng)后，再測(cè)試，才能保證測(cè)試的準(zhǔn)確性。

4.3 掃描速度對(duì)傳感器性能的影響

在配置的溶液中選取濃度為0.5×10-3mol/L的溶液五組，改變儀器的掃描速度，以0.05V/s為步長(zhǎng)，0.05V/s為初始掃描速度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示。

顯然從表2可以直觀的看出，隨著儀器掃描速度的增加，正負(fù)峰的峰值電流的差值逐漸增大，那是因?yàn)閽呙杷俣刃?，那么?shí)驗(yàn)過程中受溶液中的離子的擴(kuò)散傳遞的影響就越小，從而使電流正負(fù)峰的偏移就越小，這也就更加能反映這個(gè)化學(xué)反應(yīng)的實(shí)質(zhì)，即實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果更加準(zhǔn)確，但是掃描速度并不是越小越好，因?yàn)檫@不但會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間，更重要的是會(huì)造成電極的自我腐蝕，破壞電極，造成電極的極化現(xiàn)象，這會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，因此建議在實(shí)驗(yàn)過程中將掃描速度控制在0.08V/s-0.12V/s之間，這就能保證儀器的正常使用且得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性較高，也就能使該傳感器處于一個(gè)較好的靈敏度。

此外，選擇不同種類的激勵(lì)信號(hào)，對(duì)傳感器的測(cè)試結(jié)果也有較大的影響。再者，還有激勵(lì)信號(hào)的電壓范圍的設(shè)置，需要通過試驗(yàn)進(jìn)行選擇，否則會(huì)影響測(cè)試結(jié)果。還有水環(huán)境中存在復(fù)雜多變的基質(zhì)，會(huì)嚴(yán)重干擾免疫分析的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

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作者簡(jiǎn)介：邵玲軒（1994-），女，學(xué)生，從事生物傳感器及智能儀器方向的研究。

*通訊作者：劉源（1964-），女，教授，從事生物傳感器及智能儀器方向的研究。