顏瑛　羅玉彬　王文娟　潘影　萬承波

摘要 [目的]對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌不同的DNA提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。[方法]采取3種不同的方法對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的DNA進(jìn)行提取，利用全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)比較其濃度和純度。[結(jié)果]方法3提取的DNA質(zhì)量最好，濃度和純度都較高，方法1提取的DNA質(zhì)量次之，純度較高，濃度次之，方法2提取的DNA濃度一般，但存在碳水化合物或鹽類污染。[結(jié)論]方法3是一種適用于沙門氏菌和金黃色葡萄球菌以及其他病原菌的有效提取方法。

關(guān)鍵詞 DNA提?。簧抽T氏菌；金黃色葡萄球菌

中圖分類號(hào) S188；Q93.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）27-041-03

沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是食物中毒中常見的致病菌。沙門氏菌是革蘭氏陰性桿菌，無莢膜和芽孢，除雛沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌外絕大多數(shù)有鞭毛能運(yùn)動(dòng)[1]，菌體溶解時(shí)，其細(xì)胞壁所含的脂多糖釋放出來，形成內(nèi)毒素[2]，易引起傷寒、急性腸胃炎、菌血癥和敗血癥等疾病[3]。資料統(tǒng)計(jì)顯示，我國70%～80%的食物中毒由沙門氏菌引起[4]。金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)生較多的毒素和酶等毒力因子，引起包括食物中毒、化膿性炎癥、敗血癥、假膜性腸炎等疾病[5]。金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁較厚，90%以上金黃色葡萄球菌含有葡萄球菌蛋白A，有些金黃色葡萄球菌自身還分泌一種耐熱核酸酶的蛋白質(zhì)可以降解核酸[6]，DNA提取難度大。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)中傳統(tǒng)的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測方法需5～7 d[7-8]，費(fèi)時(shí)耗力且繁瑣。分子生物學(xué)技術(shù)因其高靈敏度、高特異性、高通量等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測技術(shù)的研究和開發(fā)，而基因組DNA的質(zhì)量直接關(guān)系到PCR及其他分子生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，筆者比較了沙門氏菌和金黃色葡萄球菌不同的DNA提取方法，獲得了一種適用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及其他病原菌的有效提取方法，為進(jìn)一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50013-8）、金黃色葡萄球菌（CMCC 26001-2d），購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

TE（10 mmol/L Tris.Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）；10%SDS；飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；氯化鈉（5 mol/L）；醋酸鈉（3 mol/L）；50×TAE；EB溶液；蛋白酶K（20 mg/ml）；溶葡萄球菌酶（1 mg/ml）；溶菌酶（50 mg/ml）；RNase（10 mg/ml）；DNA Marker；瓊脂糖；LB培養(yǎng)基。所有試劑按文獻(xiàn)[9]配制。

1.3 主要設(shè)備

Mastercycler nexus型PCR儀（Eppendorf，Germany）、GelDoc XR+ BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）、Nanodrop-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）。

1.4 菌種培養(yǎng)方法

將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌分別在平板上劃線分離，挑取單菌落，接種于滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。

1.5 基因組DNA提取

方法1：取1 ml菌懸液于1.5 ml離心管，12 000 r/min離心2 min去上清，用TE洗滌沉淀，加300 μl TE，金黃色葡萄球菌加溶葡萄球菌酶（1 mg/ml）10 μl，37 ℃作用30 min；加30 μl 10%SDS和蛋白酶K（20 mg/ml）3 μl，55 ℃水浴1 h；加入等體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻，10 000 r/min離心5 min取上清；加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）混勻，10 000 r/min離心5 min取上清；加入0.1倍體積3 mol/LNaAc和2倍體積的冰無水乙醇混勻，-20 ℃靜置30 min，離心去上清，沉淀用70%乙醇洗滌，于通風(fēng)櫥中自然干燥后加50 μl ddH2O溶解，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

方法2：取1 ml菌懸液于1.5 ml離心管，12 000 r/min離心2 min去上清，用TE洗滌沉淀，加300 μl TE，金黃色葡萄球菌加溶葡萄球菌酶（1 mg/ml）10 μl，37 ℃作用30 min；加30 μl 10%SDS和蛋白酶K（20 mg/ml）3 μl，55 ℃水浴1 h；取出置于沸水浴中高溫煮沸15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清保存?zhèn)溆谩?/p>

方法3：取1 ml菌懸液于1.5 ml離心管，12 000 r/min離心2 min去上清，用TE洗滌沉淀，加465 μl TE，加溶菌酶（50 mg/ml）4 μl、溶葡萄球菌酶（1 mg/ml）10 μl、RNase（10 mg/ml） 1 μl，0 ℃作用1 h，期間間隔搖晃幾次；取出放置-20 ℃冰箱20 min，立即放入68 ℃水浴10 min，加入10%SDS 53 μl，68 ℃水浴15 min，加入5 mol/L氯化鈉87 μl、CTAB/NaCl（1% CTAB，0.73 mol/L NaCl）69 μl，68 ℃水浴15 min，放置-20 ℃冰箱30 min，取出加入等體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻，10 000 r/min離心5 min取上清；加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）混勻，10 000 r/min離心5 min取上清；最后用2倍體積的冰無水乙醇混勻，放置-20 ℃冰箱30 min，離心去上清，沉淀用70%乙醇洗滌，于通風(fēng)櫥中自然干燥后加50 μl ddH2O溶解，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 DNA濃度和純度的測定

采用全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA進(jìn)行濃度測定，并在波長230、260、280 nm處測量吸光值，計(jì)算A260/A230、A260/A280進(jìn)行純度評(píng)估。

1.7 DNA模板電泳 提取的DNA凝膠電泳、EB染色后利用凝膠成像系統(tǒng)檢測比較[9]。

1.8 PCR擴(kuò)增 針對(duì)沙門氏菌選擇相對(duì)保守的invA基因設(shè)計(jì)引物：正向引物5′-tcatcgcaccgtcaaaggaac-3′，反向引物5′-gtgaaattatcgccacgttcggg-3′，理論擴(kuò)增長度為284 bp；針對(duì)金黃色葡萄球菌nuc基因設(shè)計(jì)引物：正向引物5′- aaagggcaatacgcaaagaggt-3′，反向引物5′-ctttagccaagccttgacgaac-3′，理論擴(kuò)增長度為484 bp[10]。2種細(xì)菌的擴(kuò)增均采用降落PCR[11]，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；隨后94 ℃變性30 s，68 ℃退火（每個(gè)循環(huán)降0.5 ℃）30 s，72 ℃延伸45 s，26個(gè)循環(huán)；然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，14個(gè)循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min，所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種不同方法提取的DNA結(jié)果與分析

由表1可知，從濃度來看，方法3提取的DNA濃度最高，方法1次之，方法2最低。從純度來看，方法1和方法3提取的DNA都較好，A260/A280均在1.8～2.0，而方法2提取的DNA低于1.8；方法1和方法3提取的DNA A260/A230均大于2.0，而方法2提取的DNA低于2.0。

由圖1可知，DNA模板電泳的結(jié)果也與全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)檢測結(jié)果相印證，方法3提取的DNA模板含量最高，條帶最亮，方法1次之，而方法2的條帶幾乎看不見。因此，綜合考慮DNA模板的濃度和純度，選擇方法3作為最佳提取方法。

注：泳道1.方法3提取的沙門氏菌DNA模板；泳道2.方法3提取的金黃色葡萄球菌DNA模板；泳道3.方法1提取的沙門氏菌DNA模板；泳道4.方法1提取的金黃色葡萄球菌DNA模板；泳道5.Marker；泳道6.方法2提取的沙門氏菌DNA模板；泳道7.方法2提取的金黃色葡萄球菌DNA模板。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用方法3提取的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌經(jīng)過PCR擴(kuò)增都得到了目標(biāo)片段，表明方法3提取的DNA可用于分子生物學(xué)方面的研究（圖2、3）。

3 討論

目前，細(xì)菌DNA提取的方法有很多，如CTAB法、SDS法、高溫煮沸法、試劑盒法、酶解法、chelex-100樹脂法[12]等，每個(gè)方法各有優(yōu)劣。從經(jīng)濟(jì)實(shí)用的角度出發(fā)，該研究選擇3種提取方法對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA提取效果進(jìn)行比較。

考慮到溶菌酶對(duì)于金黃色葡萄球菌這樣典型的革蘭氏陽性菌DNA提取效果不佳[13]，因此金黃色葡萄球菌DNA提取選擇溶葡萄球菌酶破除細(xì)胞壁來釋放細(xì)胞內(nèi)DNA。

核酸在波長 260 nm處有最高吸收峰，蛋白質(zhì)的吸收高峰在280 nm波長處，而碳水化合物的吸收高峰在230 nm波長處。A260/A280可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA的A260/A280為1.8，純RNA為2.0。如果比值低于1.8，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品，如果比值高于2.0，表示受到RNA污染，同樣要進(jìn)行純化。A260/A230也可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA和 RNA的A260/A230為2.5。若比值小于2.0表明樣品被碳水化合物、鹽類或其他小分子物質(zhì)污染，需要純化樣品。

該研究中，方法2操作簡便、時(shí)間短，但提取的純度和濃度明顯偏低，雖然利用SDS和蛋白酶K來去除蛋白質(zhì)，但高溫煮沸后并沒有去除雜質(zhì)的過程，所以在利用全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)測定純度時(shí)得到的結(jié)果不夠理想，從譜圖上可看到在230波長處有明顯的吸收峰，A260/A230比值偏低，表明受到碳水化合物、鹽類或其他小分子物質(zhì)污染，這與牟愷[14]的結(jié)果一致。方法1在方法2的基礎(chǔ)上增加了用氯仿/異戊醇的除雜過程，再加上用乙醇來沉淀核酸，純度比方法2提高，但金黃色葡萄球菌也因?yàn)樵黾釉囼?yàn)步驟導(dǎo)致DNA損耗而濃度稍下降，且方法2和方法1因?yàn)闆]有去除RNA的過程，所以在圖1的電泳圖譜也可以看到有RNA條帶。方法3中增加溶菌酶與溶葡萄球菌酶協(xié)同破除細(xì)胞壁，用RNase來降解RNA，后續(xù)再增加CTAB/NaCl等除雜過程，得到的DNA濃度高，純度好，采用PCR擴(kuò)增試驗(yàn)也得到了目的片段，表明方法3提取的DNA對(duì)PCR擴(kuò)增無抑制作用，適用于其他分子生物學(xué)操作。

沙門氏菌是典型的革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽性菌，該研究為病原菌高質(zhì)量的DNA提取提供了解決方案，從而為后續(xù)的基因操作和快速檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

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