顏瑛　羅玉彬　王文娟　潘影　萬(wàn)承波

摘要 [目的]對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌不同的DNA提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。[方法]采取3種不同的方法對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的DNA進(jìn)行提取，利用全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)比較其濃度和純度。[結(jié)果]方法3提取的DNA質(zhì)量最好，濃度和純度都較高，方法1提取的DNA質(zhì)量次之，純度較高，濃度次之，方法2提取的DNA濃度一般，但存在碳水化合物或鹽類污染。[結(jié)論]方法3是一種適用于沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌以及其他病原菌的有效提取方法。

關(guān)鍵詞 DNA提??；沙門(mén)氏菌；金黃色葡萄球菌

中圖分類號(hào) S188；Q93.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）27-041-03

沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌是食物中毒中常見(jiàn)的致病菌。沙門(mén)氏菌是革蘭氏陰性桿菌，無(wú)莢膜和芽孢，除雛沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌外絕大多數(shù)有鞭毛能運(yùn)動(dòng)[1]，菌體溶解時(shí)，其細(xì)胞壁所含的脂多糖釋放出來(lái)，形成內(nèi)毒素[2]，易引起傷寒、急性腸胃炎、菌血癥和敗血癥等疾病[3]。資料統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)70%～80%的食物中毒由沙門(mén)氏菌引起[4]。金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，能產(chǎn)生較多的毒素和酶等毒力因子，引起包括食物中毒、化膿性炎癥、敗血癥、假膜性腸炎等疾病[5]。金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁較厚，90%以上金黃色葡萄球菌含有葡萄球菌蛋白A，有些金黃色葡萄球菌自身還分泌一種耐熱核酸酶的蛋白質(zhì)可以降解核酸[6]，DNA提取難度大。目前，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法需5～7 d[7-8]，費(fèi)時(shí)耗力且繁瑣。分子生物學(xué)技術(shù)因其高靈敏度、高特異性、高通量等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)，而基因組DNA的質(zhì)量直接關(guān)系到PCR及其他分子生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，筆者比較了沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌不同的DNA提取方法，獲得了一種適用于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌及其他病原菌的有效提取方法，為進(jìn)一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠傷寒沙門(mén)氏菌（CMCC 50013-8）、金黃色葡萄球菌（CMCC 26001-2d），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

TE（10 mmol/L Tris.Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）；10%SDS；飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；氯化鈉（5 mol/L）；醋酸鈉（3 mol/L）；50×TAE；EB溶液；蛋白酶K（20 mg/ml）；溶葡萄球菌酶（1 mg/ml）；溶菌酶（50 mg/ml）；RNase（10 mg/ml）；DNA Marker；瓊脂糖；LB培養(yǎng)基。所有試劑按文獻(xiàn)[9]配制。

1.3 主要設(shè)備

Mastercycler nexus型PCR儀（Eppendorf，Germany）、GelDoc XR+ BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）、Nanodrop-1000全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）。

1.4 菌種培養(yǎng)方法

將沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌分別在平板上劃線分離，挑取單菌落，接種于滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

1.5 基因組DNA提取

方法1：取1 ml菌懸液于1.5 ml離心管，12 000 r/min離心2 min去上清，用TE洗滌沉淀，加300 μl TE，金黃色葡萄球菌加溶葡萄球菌酶（1 mg/ml）10 μl，37 ℃作用30 min；加30 μl 10%SDS和蛋白酶K（20 mg/ml）3 μl，55 ℃水浴1 h；加入等體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻，10 000 r/min離心5 min取上清；加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）混勻，10 000 r/min離心5 min取上清；加入0.1倍體積3 mol/LNaAc和2倍體積的冰無(wú)水乙醇混勻，-20 ℃靜置30 min，離心去上清，沉淀用70%乙醇洗滌，于通風(fēng)櫥中自然干燥后加50 μl ddH2O溶解，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

方法2：取1 ml菌懸液于1.5 ml離心管，12 000 r/min離心2 min去上清，用TE洗滌沉淀，加300 μl TE，金黃色葡萄球菌加溶葡萄球菌酶（1 mg/ml）10 μl，37 ℃作用30 min；加30 μl 10%SDS和蛋白酶K（20 mg/ml）3 μl，55 ℃水浴1 h；取出置于沸水浴中高溫煮沸15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清保存?zhèn)溆谩?/p>

方法3：取1 ml菌懸液于1.5 ml離心管，12 000 r/min離心2 min去上清，用TE洗滌沉淀，加465 μl TE，加溶菌酶（50 mg/ml）4 μl、溶葡萄球菌酶（1 mg/ml）10 μl、RNase（10 mg/ml） 1 μl，0 ℃作用1 h，期間間隔搖晃幾次；取出放置-20 ℃冰箱20 min，立即放入68 ℃水浴10 min，加入10%SDS 53 μl，68 ℃水浴15 min，加入5 mol/L氯化鈉87 μl、CTAB/NaCl（1% CTAB，0.73 mol/L NaCl）69 μl，68 ℃水浴15 min，放置-20 ℃冰箱30 min，取出加入等體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻，10 000 r/min離心5 min取上清；加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）混勻，10 000 r/min離心5 min取上清；最后用2倍體積的冰無(wú)水乙醇混勻，放置-20 ℃冰箱30 min，離心去上清，沉淀用70%乙醇洗滌，于通風(fēng)櫥中自然干燥后加50 μl ddH2O溶解，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 DNA濃度和純度的測(cè)定

采用全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，并在波長(zhǎng)230、260、280 nm處測(cè)量吸光值，計(jì)算A260/A230、A260/A280進(jìn)行純度評(píng)估。

1.7 DNA模板電泳 提取的DNA凝膠電泳、EB染色后利用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)比較[9]。

1.8 PCR擴(kuò)增 針對(duì)沙門(mén)氏菌選擇相對(duì)保守的invA基因設(shè)計(jì)引物：正向引物5′-tcatcgcaccgtcaaaggaac-3′，反向引物5′-gtgaaattatcgccacgttcggg-3′，理論擴(kuò)增長(zhǎng)度為284 bp；針對(duì)金黃色葡萄球菌nuc基因設(shè)計(jì)引物：正向引物5′- aaagggcaatacgcaaagaggt-3′，反向引物5′-ctttagccaagccttgacgaac-3′，理論擴(kuò)增長(zhǎng)度為484 bp[10]。2種細(xì)菌的擴(kuò)增均采用降落PCR[11]，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；隨后94 ℃變性30 s，68 ℃退火（每個(gè)循環(huán)降0.5 ℃）30 s，72 ℃延伸45 s，26個(gè)循環(huán)；然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，14個(gè)循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min，所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種不同方法提取的DNA結(jié)果與分析

由表1可知，從濃度來(lái)看，方法3提取的DNA濃度最高，方法1次之，方法2最低。從純度來(lái)看，方法1和方法3提取的DNA都較好，A260/A280均在1.8～2.0，而方法2提取的DNA低于1.8；方法1和方法3提取的DNA A260/A230均大于2.0，而方法2提取的DNA低于2.0。

由圖1可知，DNA模板電泳的結(jié)果也與全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果相印證，方法3提取的DNA模板含量最高，條帶最亮，方法1次之，而方法2的條帶幾乎看不見(jiàn)。因此，綜合考慮DNA模板的濃度和純度，選擇方法3作為最佳提取方法。

注：泳道1.方法3提取的沙門(mén)氏菌DNA模板；泳道2.方法3提取的金黃色葡萄球菌DNA模板；泳道3.方法1提取的沙門(mén)氏菌DNA模板；泳道4.方法1提取的金黃色葡萄球菌DNA模板；泳道5.Marker；泳道6.方法2提取的沙門(mén)氏菌DNA模板；泳道7.方法2提取的金黃色葡萄球菌DNA模板。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用方法3提取的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增都得到了目標(biāo)片段，表明方法3提取的DNA可用于分子生物學(xué)方面的研究（圖2、3）。

3 討論

目前，細(xì)菌DNA提取的方法有很多，如CTAB法、SDS法、高溫煮沸法、試劑盒法、酶解法、chelex-100樹(shù)脂法[12]等，每個(gè)方法各有優(yōu)劣。從經(jīng)濟(jì)實(shí)用的角度出發(fā)，該研究選擇3種提取方法對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA提取效果進(jìn)行比較。

考慮到溶菌酶對(duì)于金黃色葡萄球菌這樣典型的革蘭氏陽(yáng)性菌DNA提取效果不佳[13]，因此金黃色葡萄球菌DNA提取選擇溶葡萄球菌酶破除細(xì)胞壁來(lái)釋放細(xì)胞內(nèi)DNA。

核酸在波長(zhǎng) 260 nm處有最高吸收峰，蛋白質(zhì)的吸收高峰在280 nm波長(zhǎng)處，而碳水化合物的吸收高峰在230 nm波長(zhǎng)處。A260/A280可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA的A260/A280為1.8，純RNA為2.0。如果比值低于1.8，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品，如果比值高于2.0，表示受到RNA污染，同樣要進(jìn)行純化。A260/A230也可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA和 RNA的A260/A230為2.5。若比值小于2.0表明樣品被碳水化合物、鹽類或其他小分子物質(zhì)污染，需要純化樣品。

該研究中，方法2操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短，但提取的純度和濃度明顯偏低，雖然利用SDS和蛋白酶K來(lái)去除蛋白質(zhì)，但高溫煮沸后并沒(méi)有去除雜質(zhì)的過(guò)程，所以在利用全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)測(cè)定純度時(shí)得到的結(jié)果不夠理想，從譜圖上可看到在230波長(zhǎng)處有明顯的吸收峰，A260/A230比值偏低，表明受到碳水化合物、鹽類或其他小分子物質(zhì)污染，這與牟愷[14]的結(jié)果一致。方法1在方法2的基礎(chǔ)上增加了用氯仿/異戊醇的除雜過(guò)程，再加上用乙醇來(lái)沉淀核酸，純度比方法2提高，但金黃色葡萄球菌也因?yàn)樵黾釉囼?yàn)步驟導(dǎo)致DNA損耗而濃度稍下降，且方法2和方法1因?yàn)闆](méi)有去除RNA的過(guò)程，所以在圖1的電泳圖譜也可以看到有RNA條帶。方法3中增加溶菌酶與溶葡萄球菌酶協(xié)同破除細(xì)胞壁，用RNase來(lái)降解RNA，后續(xù)再增加CTAB/NaCl等除雜過(guò)程，得到的DNA濃度高，純度好，采用PCR擴(kuò)增試驗(yàn)也得到了目的片段，表明方法3提取的DNA對(duì)PCR擴(kuò)增無(wú)抑制作用，適用于其他分子生物學(xué)操作。

沙門(mén)氏菌是典型的革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌，該研究為病原菌高質(zhì)量的DNA提取提供了解決方案，從而為后續(xù)的基因操作和快速檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 王德寧.雞源沙門(mén)氏菌耐藥性、致病性與毒力基因相關(guān)性分析[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[2] 陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[3] 王學(xué)碩，崔生輝，邢書(shū)霞，等.餐飲食品中沙門(mén)氏菌的危害分析、污染調(diào)查與防控[J].中國(guó)藥事，2013，27（9）：974-979.

[4] 曾曉芳.畜產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌污染的檢測(cè)與控制[J].四川畜牧獸醫(yī)，2003，30（4）：28-29.

[5] FRANKLIN D，LOWY M D.Staphylococcus aureus infections[J].N Engl J Med， 1998， 339（8）：520-532.

[6] 唐俊妮.金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶相關(guān)基因的功能與特征分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[7] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)：GB 4789.4-2010[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[8] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)：GB 4789.10-2010[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[9] J 薩姆布魯克，D·W·拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂，譯.3版.北京：科學(xué)出版社，2002.

[10] 牟愷，陳智，王春民，等.同時(shí)檢測(cè)四種病原菌的PCR方法研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010（2）：253-257.

[11] 李玉恒，趙明慧，趙紫陽(yáng)，等.利用梯度PCR和降落PCR擴(kuò)增CIRP基因的比較[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2011（5）：46-49，75.

[12] 錢(qián)雪琴，張軍，沈芳.Chelex-100法和堿性裂解法提取細(xì)菌DNA的比較[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008（8）：1565-1566.

[13] 任曉東，李一松，姜毓君.優(yōu)化金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取方法[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（1）：92-96.

[14] 牟愷.同時(shí)檢測(cè)四種病原菌的PCR方法的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.