顧麗娟等

摘要：目的 探討當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)過氧化氫（H2O2）致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中熱休克蛋白70（HSP70）及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)的影響。方法 H2O2誘導(dǎo)ECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡制備模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組、單純藥物組、藥物干預(yù)組，并給予相應(yīng)藥物干預(yù)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，RT-PCR法檢測HSP70、eNOS的基因表達(dá)，蛋白印跡法檢測HSP70的蛋白表達(dá)，硝酸還原酶法及分光光度法檢測一氧化氮（NO）的含量。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯增加、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯上升（P<0.05），細(xì)胞HSP70基因和蛋白表達(dá)上調(diào)、eNOS基因表達(dá)下調(diào)及NO含量降低（P<0.05）；與模型組比較，藥物干預(yù)組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯降低（P<0.05），細(xì)胞HSP70基因和蛋白表達(dá)上調(diào)、eNOS基因表達(dá)上調(diào)及NO含量升高（P<0.05）。結(jié)論 當(dāng)歸紅芪超濾物通過上調(diào)HSP70、eNOS的表達(dá)及NO含量，降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載，發(fā)揮抗H2O2致ECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸紅芪超濾物；過氧化氫；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.015

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）04-0051-04

Effects of Ultra-filtration Extract from Angelicae Sinensis Radix and Hedysarum Polybotrys on Expressions of HSP70 and eNOS in H2O2-induced Endothelial Cell Apoptosis GU Li-juan， LIU Kai， SUN Shao-bo， LIU Guo-an， LI Ying-dong （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of ultra-filtration extract from the mixture of Angelicae Sinensis Radix and Hedysarum Polybotrys （UFE-AH） on the expressions of HSP70 and eNOS in H2O2-induced endothelial cell apoptosis. Methods H2O2 induced ECV-304 cell apoptosis to prepare models. The experiment was divided into normal control group， model group， simple medicine group， medicine intervention group， and all treatment groups received relevant medicine for intervention. Flow cytometry （FCM） was used to detect apoptosis and concentration of intracellular Ca2+；RT-PCR was used to detect the mRNA expression of HSP70 and eNOS；Western blot was used to detect the expression of HSP70 protein；Nitrale reduetase and spectrophotometric method were employed to detect the content of NO. Results Compared with normal control group， cell apoptosis rate， concentration of intracellular Ca2+， and expression of HSP70 increased significantly in model group （P<0.05）；gene expression of eNOS mRNA and content of NO decreased （P<0.05）. Compared with model group， cell apoptosis rate and concentration of intracellular Ca2+ dropped in medicine intervention group （P<0.05）；expressions of HSP70， eNOS mRNA and content of NO increased （P<0.05）. Conclusion UFE-AH can confront H2O2-induced cell apoptosis H2O2 of ECV-304 human umbilical vein endothelial by increasing the expressions of HSP70 and eNOS and content of NO， and reducing the intracellular calcium overload.

Key words：UFE-AH；H2O2；human umbilical vein endothelial cell；cell apoptosis

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃（1010RJZA174）

通訊作者：劉凱，E-mail：xubo_l@163.com

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是常見心腦血管疾病的始發(fā)因素，氧化損傷是主要原因及機(jī)制之一，防治內(nèi)皮細(xì)胞損傷可使心腦血管病患者獲益。研究表明，多種中藥具有抗氧化損傷作用，提示其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷具有拮抗作用[1]。本課題組前期研究表明，益氣補(bǔ)血中藥當(dāng)歸、紅芪（1∶5）配伍后經(jīng)超濾技術(shù)提取的有效組分具有抗氧化、改善心肌缺血等功效[2-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究0～10萬分子量范圍的當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)過氧化氫（H2O2）致ECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷后細(xì)胞凋亡率、鈣超載、熱休克蛋白70（HSP70）及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表達(dá)的影響，為其在臨床防治心腦血管疾病的推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

當(dāng)歸采自甘肅岷縣，紅芪采自甘肅宕昌，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為傘形科當(dāng)歸屬Angelica Sinensis （Oliv.）Diels的根和豆科紅花巖黃芪屬植物多序黃芪Hedysarum Polybotrys Hand.- Mazz.的干燥根莖。按比例配伍，經(jīng)水煎，微濾，超濾，噴霧干燥等工藝制備，參照文獻(xiàn)[6]，由甘肅中醫(yī)學(xué)院、甘肅膜科學(xué)技術(shù)研究院及蘭州佛慈制藥股份有限公司聯(lián)合制備藥物。高效液相色譜法檢測指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量控制[樣品用50%甲醇溶解，微波助溶， Inertsil ODS-SP G8色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），檢測波長275 nm，甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～20 min，3∶97；20～40 min，20∶80；40～50 min， 60∶40；50～60 min，90∶10）]。

1.2 細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304細(xì)胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（編號(hào)GDC023）。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶：GIBCO公司；過氧化氫：天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20130331；總RNA抽提試劑盒、RT-PCR反應(yīng)試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司；Maker：1000 bp DNA ladder，大連寶生物有限公司；HSP70、eNOS基因引物：南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Fluo-3試劑盒：美國Sigma公司；AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡試劑盒：Invitrogen公司；兔抗鼠Hsp70、β-actin多克隆抗體：Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG：武漢博士德生物工程有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒：南京建成生物工程研究所。XL型流式細(xì)胞儀：美國Coulter公司；PE2400型PCR擴(kuò)增儀：美國PE公司；BTS-20.M型凝膠成像分析系統(tǒng)：Uvitec公司產(chǎn)品；DYCP31A型電泳槽、HV-3000型電泳儀：北京市六一儀器廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組

參照文獻(xiàn)[7]方法。將ECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞按1.0×l05個(gè)/mL密度接種，配制含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL的低糖DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔1.5 d換液。200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（完全培養(yǎng)基中加與各組等量的生理鹽水常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞32 h后換液，完全培養(yǎng)基中加與各組等量的生理鹽水常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞6 h）、單純藥物組（完全培養(yǎng)基中加終濃度6 g/L的當(dāng)歸紅芪超濾物培養(yǎng)32 h后換液，完全培養(yǎng)基中加終濃度6 g/L當(dāng)歸紅芪超濾物培養(yǎng)6 h）、模型組（完全培養(yǎng)基中加與各組等量的生理鹽水常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞32 h后換液，完全培養(yǎng)基中加終濃度200 μmol/L H2O2培養(yǎng)6 h）、藥物干預(yù)組（完全培養(yǎng)基中加終濃度6 g/L當(dāng)歸紅芪超濾物培養(yǎng)32 h后換液，完全培養(yǎng)基中加終濃度200 μmol/L H2O2培養(yǎng)6 h）。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，在染色緩沖液中5×105/mL重懸細(xì)胞，吸取100 μL細(xì)胞（1×105）至試管中，加入5 μL的熒光標(biāo)記的Annexin V試劑和3 μL碘化丙啶，混勻后避光室溫孵育15 min，孵育后加入400 μL染色緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量

常規(guī)消化、離心、收集各組細(xì)胞，用冷PBS洗滌細(xì)胞，加2 mL細(xì)胞孵育液、1 mmol/L Fluo3-AM 8 μL， 30 ℃水浴孵育20 min，洗滌細(xì)胞2次后懸浮細(xì)胞，于激發(fā)波長506 nm、發(fā)射波長526 nm，測定熒光值F。加入100 μL含20%Triton X-100和20 mmol/L CaCl2溶液100 μL，測得Fmax，再加pH 7.0 200 mmol/L EGTA 100 μL，測得Fmin。[Ca2+]=Kd[（F-Fmin）/（Fmax-F）]，其中Kd=0.40 μmmol/L。

2.4 RT-PCR法檢測熱休克蛋白70及內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因的表達(dá)

常規(guī)消化、離心、收集各組細(xì)胞，按試劑盒說明提取總RNA。根據(jù)文獻(xiàn)選用特異性引物[7-8]。HSP70上游引物：5'-AAGGTGGAGATCATCGCCAA-3'，HSP70下游引物：5'-GCGATCTCCTTCTTCATCTTGGT-3'；eNOS上游引物：5'-CAAGTTCCCTCGTGTGAAGAACTG-3'，eNOS下游引物：5'-GAGCTGTAGTACTGGTTGATGAAGTC-3'；β-actin上游引物：5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，β-actin下游引物：5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3'。產(chǎn)物長度：HSP70 300 bp，eNOS 214 bp，β-actin 302 bp。根據(jù)RT-PCR反應(yīng)試劑盒說明及參考文獻(xiàn)設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。各組取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像成像系統(tǒng)分析各條帶的光密度，以目的基因條帶與內(nèi)參基因（β-actin）條帶的光密度比值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.5 蛋白印跡法檢測熱休克蛋白70的蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，PBS洗滌，裂解細(xì)胞提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度。每組各取50 μL蛋白，經(jīng)SDS PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加HSP70，β-actin抗體4 ℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG于37 ℃孵育1 h，加ECL發(fā)光試劑孵育1 min，暗室將膜在感光膠片上曝光，加顯影液，定影液洗像。用Alpha Imager 2200圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算HSP70與β-actin灰度比值。

2.6 一氧化氮含量測定

按試劑盒說明書操作，應(yīng)用硝酸還原酶法及分光光度法測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間計(jì)量資料采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)過氧化氫致內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡的影響

D1象限代表細(xì)胞收集過程中機(jī)械損傷細(xì)胞碎片；D2象限代表晚期凋亡與壞死細(xì)胞；D3象限代表正常細(xì)胞；D4象限代表早期凋亡細(xì)胞。與正常對(duì)照組比較，模型組早期凋亡細(xì)胞百分率均明顯上升、正常細(xì)胞百分率明顯下降（P<0.05），單純藥物組早期凋亡細(xì)胞百分率有下降趨勢、正常細(xì)胞百分率有上升趨勢；與模型組比較，單純藥物組、藥物干預(yù)組正常細(xì)胞百分率明顯上升、早期凋亡細(xì)胞百分率明顯下降（P<0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)過氧化氫致內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯上升（P<0.05）；與模型組比較，藥物干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯下降（P<0.05）。結(jié)果見表2。

4.3 當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)過氧化氫致?lián)p傷內(nèi)皮細(xì)胞熱休克蛋白70、內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞HSP70 mRNA表達(dá)明顯上升、eNOS mRNA表達(dá)明顯下降，單純藥物組細(xì)胞eNOS mRNA表達(dá)有增高的趨勢；與模型組比較，藥物干預(yù)組細(xì)胞HSP70、eNOS mRNA表達(dá)明顯上升（P<0.05）。結(jié)果見表3、圖1。

4.4 當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)過氧化氫致?lián)p傷內(nèi)皮細(xì)胞熱休克蛋白70蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)明顯上升（P<0.05）；與模型組比較，藥物干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)上升（P<0.05）。結(jié)果見表4、圖2。

4.5 當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)過氧化氫致?lián)p傷內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮含量的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組NO含量明顯下降，單純藥物組NO含量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，單純藥物組、藥物干預(yù)組NO含量明顯升高（P<0.05）。結(jié)果見表5。

5 討論

H2O2損傷細(xì)胞是經(jīng)典的細(xì)胞學(xué)氧化損傷模型。H2O2作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生的活性氧引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常，離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，異常升高的Ca2+造成脂質(zhì)過氧化，激活磷酸酶、蛋白酶及細(xì)胞骨架的改變，形成惡性循環(huán)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。熱休克蛋白又稱應(yīng)激蛋白，HSP70通過分子伴侶功能發(fā)揮細(xì)胞與臟器保護(hù)作用。作為分子伴侶，HSP70具有明顯減輕細(xì)胞損傷的作用，也可通過多種途徑抑制凋亡的發(fā)生，對(duì)許多細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激起保護(hù)作用。HSP70可通過抑制氧自由基的關(guān)鍵酶的產(chǎn)生，減少細(xì)胞損傷后自由基的產(chǎn)生；增加內(nèi)源性過氧化酶水平，清除氧自由基；抑制細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，拮抗活性氧介導(dǎo)的鈣超載引起的細(xì)胞損傷與凋亡。eNOS是內(nèi)皮功能完整性標(biāo)志酶之一，eNOS是鈣依賴蛋白酶，通過催化精氨酸合成內(nèi)皮源性舒張因子NO，維持血管內(nèi)皮的正常生理功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2可以造成離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，在凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了鈣超載，HSP70作為一種保護(hù)性蛋白其表達(dá)明顯升高，H2O2損傷影響了內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理功能，eNOS基因表達(dá)水平下降，NO合成與分泌明顯降低。當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)H2O2引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有拮抗作用，具有抗H2O2致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，具有減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，促進(jìn)HSP70基因的表達(dá)、維持正常內(nèi)皮細(xì)胞功能、上調(diào)eNOS表達(dá)、維持NO合成與分泌的作用。當(dāng)歸紅芪超濾物單用對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有減少自然凋亡率、eNOS基因表達(dá)、促進(jìn)NO合成與分泌明顯的趨勢。本研究結(jié)果提示，當(dāng)歸紅芪超濾物具有抗內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷、維持血管內(nèi)皮功能穩(wěn)態(tài)的作用，對(duì)預(yù)防及治療心腦血管疾病具有積極意義。

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（收稿日期：2014-06-18；編輯：華強(qiáng)）