段小花等

摘要：目的 采用高效液相色譜法（HPLC）測定天麻成分對甲氧基芐醇在大鼠血液中的藥代動力學參數(shù)。方法 采用灌胃和靜脈注射2種方式給藥，HPLC測定不同時間大鼠血液中天麻成分對甲氧基芐醇的濃度，DAS3.0軟件計算藥代動力學參數(shù)。結(jié)果 大鼠血液中對甲氧基芐醇在0.63～321.17 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2=0.994 5；日內(nèi)、日間精密度、絕對回收率和穩(wěn)定性均在規(guī)定范圍內(nèi)。結(jié)論 本方法操作簡便，能較準確地測出天麻成分對甲氧基芐醇在大鼠血液中的藥代動力學參數(shù)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；對甲氧基芐醇；藥代動力學；大鼠

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0099-04

目前對于天麻的藥代動力學研究大多以天麻素為主[1-2]。藥代動力學對于指導臨床安全合理用藥及新藥研發(fā)都具有重要意義[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天麻成分對甲氧基芐醇具有較好的腦保護作用，因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測定其在大鼠血液中的藥代動力學參數(shù)，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 動物、儀器與試藥

SD大鼠，清潔級，雄性，10周齡，體質(zhì)量220～250 g，四川省醫(yī)學科學研究院動物研究所提供，動物合格證號SCXK（川）2008-24。

反相高效液相色譜儀，UltiMate3000；TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國Agilent；離心機， HITACHI；旋渦混合器XW-80A，上海精科實業(yè)有限公司。

對甲氧基芐醇，25 g，北京百靈威科技有限公司，批號134868。HPLC級甲醇，美國Spectrum；HPLC級乙腈，美國Spectrum；娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同給藥方式的樣品處理

2.1.1 靜脈注射 精密稱取0.125 0 g對甲氧基芐醇于25 mL容量瓶中，用10%乙醇定容，0.45 μm孔徑膜過濾備用。將大鼠用10%水合氯醛麻醉（0.3 mL/100 g），固定于鼠板，剪開頸部皮膚，鈍性分離找到頸動脈，小心剝離迷走神經(jīng)，遠心端手術(shù)線結(jié)扎頸動脈，近心端用止血夾夾住，在手術(shù)線和止血夾之間的頸動脈血管上剪出小口，插入塑料細管，手術(shù)線結(jié)扎細管與血管貼壁處。在不同時間點松開止血夾即可取血。尾靜脈注射給藥量為50 mg/kg。分別于給藥后2、4、6、8、10、12、20、30、45 min取血0.3 mL，6000 r/min離心10 min，取血漿0.1 mL，加入0.5 mL乙腈沉淀蛋白，渦旋3 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液氮氣吹干，加入流動相0.4 mL，渦旋3 min，10 000 r/min離心10 min，裝入含內(nèi)存管進樣品，HPLC進樣自動檢測。

2.1.2 灌胃 精密稱取1.600 1 g對甲氧基芐醇于25 mL燒杯中，加入20 mL水，加入0.100 2 g羧甲基纖維素鈉（即0.5%濃度），充分攪拌混勻備用。口服給藥量為800 mg/kg。大鼠灌胃相應(yīng)藥物后用10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，固定于鼠板，剪開頸部皮膚，鈍性分離找到頸動脈，小心剝離迷走神經(jīng)，遠心端手術(shù)線結(jié)扎頸動脈，近心端用止血夾夾住，在手術(shù)線和止血夾之間的頸動脈血管上剪出小口，插入塑料細管，手術(shù)線結(jié)扎細管與血管貼壁處。在不同時間點松開止血夾即可取血。分別于給藥后10、13、16、19、22、25、30、45、60 min取血0.3 mL，6000 r/min離心10 min，取血漿0.1 mL，加入0.5 mL乙腈沉淀蛋白，渦旋3 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液氮氣吹干，加入流動相0.4 mL，渦旋3 min，10 000 r/min離心10 min，裝入含內(nèi)存管進樣品，HPLC進樣自動檢測。

2.2 測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動相為甲醇-水（35∶65），流速0.3 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μL，檢測波長278 nm，目標峰與雜質(zhì)峰能有效分離，兩者分離度>1.5，符合要求。對甲氧基芐醇的保留時間在9.7 min左右。色譜圖見圖1。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取192.70 mg對甲氧基芐醇于250 mL容量瓶中，乙腈定容，作為母液。制備濃度為321.17、160.59、80.29、40.15、20.07、10.04、5.02、2.51、1.25、0.63 μg/mL的含藥血樣，制作標準曲線，計算得回歸方程Y=0.0663X-0.2181（r2=0.9945）。

2.2.3 最低檢測限和最低定量限 在制作標準曲線時，含藥血清相應(yīng)峰高與噪音峰高比值即信噪比（S/N）為3∶1時的濃度即為最低檢測限（LOD），S/N為10∶1時的濃度為最低定量限（LOQ）。結(jié)果測得對甲氧基芐醇的最低檢測限為0.19 μg/mL，最低定量限為0.63 μg/mL。

2.2.4 精密度和絕對回收率 將高（360 μg/mL）、中（100 μg/mL）、低（30 μg/mL）3種濃度的含藥血樣及同濃度標準含藥溶液，連續(xù)測定5次，得到對照品峰面積，代入標準曲線計算得到對照品濃度，計算RSD，考察方法的日內(nèi)精密度，分別3 d重復操作考察方法的日間精密度。要求低濃度的精密度RSD在±20%之間，中、高濃度的精密度RSD在15%范圍內(nèi)。結(jié)果其精密度均符合要求，見表1。

將高、中、低3種濃度的含藥血樣及同濃度標準含藥溶液進行HPLC測定，二者峰面積的比值即為該濃度藥物在血中的絕對回收率，結(jié)果見表2。

2.2.5 凍融試驗 將低、中、高3種濃度的含藥血樣置于-20 ℃冰箱24、48 h和反復凍融3次后測定其含藥量的變化，計算RSD值。要求低濃度的精密度RSD在±20%之間，中、高濃度的精密度RSD在15%范圍內(nèi)。結(jié)果見表3?？梢钥闯觯瑑鋈谧兓辉谝蠓秶鷥?nèi)，故本試驗均應(yīng)取血后立即處理并于當日檢測，盡量避免長時間反復凍融。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 制備高、中、低3個濃度的含藥血樣3份，分別在室溫下放置10、24 h，然后進樣測定，將測得的結(jié)果與0時測得的結(jié)果進行比較考察藥物的穩(wěn)定性。結(jié)果含對甲氧基芐醇的血液分別在室溫下放置10、24 h和按“2.1”樣品處理方法得到的樣品室溫下放置24 h后的數(shù)據(jù)與0時測得的結(jié)果進行比較，樣品在上述條件下是穩(wěn)定的，見表4。

2.3 天麻成分對甲氧基芐醇在大鼠血液中的藥代動力學參數(shù)

采用DAS3.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，繪制藥物濃度-時間曲線，見圖2。對甲氧基芐醇的藥代動力學參數(shù)以非房室模型統(tǒng)計矩計算，見表5。天麻成分對甲氧基芐醇的絕對生物利用度為35.5%。

3 討論

隨著分析技術(shù)的發(fā)展，色譜技術(shù)在進樣方式、分離模式、檢測技術(shù)及適用對象等方面也得到迅速發(fā)展，是藥代動力學研究中不可缺少的一項技術(shù)[3]。HPLC是研究生物樣品及其代謝產(chǎn)物非常重要的方法，不受樣品揮發(fā)性的約束，適用范圍非常廣，分離效率高而且組分容易回收，穩(wěn)定性好，靈敏度高，是目前藥代動力學研究中常用的分析方法。建立穩(wěn)定、精確的對甲氧基芐醇專屬HPLC測定方法是對甲氧基芐醇在血液中藥代動力學參數(shù)檢測的前提條件，也是檢測過程的方法學保障。

靜脈注射給藥時，藥物直接迅速進入血液而不受吸收的影響[4]。因此，可以單純研究對甲氧基芐醇在血液中的變化情況，不受其他影響因素的干擾。由于其他給藥方式指標成分需經(jīng)過許多復雜的過程才會進入血液，如果僅有微量藥物進入血液，再經(jīng)過多個步驟的樣品處理，可能會導致在血液中檢測不到目標成分[5]。靜脈注射給藥對于首次研究對甲氧基芐醇在血液中的變化情況有積極的意義，對甲氧基芐醇直接靜脈給藥可以明確得知血液中肯定含有該成分，在確定樣品處理方法的時候操作難度就會減小，可以得到更為優(yōu)化、精確的實驗體系和方法[6-7]。

口服給藥是常用的給要途徑，其吸收部位是胃腸道，影響因素有很多，如藥物本身的理化性質(zhì)和胃腸功能等。天麻的使用方法主要為口服給藥，研究灌胃給藥后大鼠血液中對甲氧基芐醇的藥代動力學參數(shù)可以為天麻成分對甲氧基芐醇的臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)，包括對甲氧基芐醇給藥時間間隔、藥物在血液中的變化過程等。

參考文獻：

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（收稿日期：2014-11-25；編輯：陳靜）