趙晶等

摘要：目的 觀察仙附溫陽通絡(luò)飲對(duì)血栓閉塞性脈管炎（TAO）模型大鼠抗中性粒細(xì)胞抗體（ANCA）相關(guān)抗原的影響，探討其作用機(jī)制。方法 SPF級(jí)Wistar雄性成年大鼠72只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、脈絡(luò)寧顆粒組及仙附溫陽通絡(luò)飲低、中、高劑量組。以股動(dòng)脈注射月桂酸鈉溶液方法造模。造模后次日開始給藥，假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水灌胃，其他各組給予相應(yīng)藥物灌胃。給藥15 d后取材，采用紫外分光光度法檢測(cè)血清中髓過氧化物酶（MPO）活性，免疫組化法檢測(cè)股動(dòng)脈及周圍組織中蛋白酶3（PR3）和溶酶體相關(guān)膜蛋白-2（LAMP-2）蛋白表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中MPO活性及PR3、LAMP-2蛋白表達(dá)均升高；與模型組比較，各給藥組MPO活性及PR3、LAMP-2蛋白表達(dá)降低，其中仙附溫陽通絡(luò)飲中劑量組下降最明顯。結(jié)論 仙附溫陽通絡(luò)飲可能通過降低ANCA相關(guān)抗原水平，進(jìn)一步抑制體液免疫功能亢進(jìn)。

關(guān)鍵詞：仙附溫陽通絡(luò)飲；血栓閉塞性脈管炎；抗中性粒細(xì)胞抗體；髓過氧化物酶；蛋白酶3；溶酶體相關(guān)膜蛋白-2；體液免疫；大鼠

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）06-0080-04

血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans， TAO）是一種節(jié)段性、非粥樣硬化性、阻塞性血管疾病，病變主要累及肢體遠(yuǎn)端的中小動(dòng)脈和靜脈，屬中醫(yī)“脫疽”范疇。由于該病具有高致殘率及易復(fù)發(fā)特性，且流行病學(xué)調(diào)查顯示，其發(fā)病年齡有提前趨勢(shì)，非吸煙人群及女性也有發(fā)生[1]，因而引起學(xué)者的廣泛關(guān)注和深入研究。前期臨床研究表明，仙附溫陽通絡(luò)飲對(duì)TAO具有獨(dú)特的療效[2]。本研究通過觀察仙附溫陽通絡(luò)飲對(duì)TAO模型大鼠血清及組織中抗中性粒細(xì)胞抗體（ANCA）特異性抗原髓過氧化物酶（MPO）活性及蛋白酶3（PR3）、溶酶體相關(guān)膜蛋白-2（LAMP-2）蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

Wistar雄性成年大鼠72只，體質(zhì)量（300±50）g， SPF級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng)，水和飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司）自由飲食，水為pH 3.0酸化純凈水。

1.2 藥物

仙附溫陽通絡(luò)飲方（附子、淫羊藿、黃芪、黨參、肉桂、赤芍等），江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)1405057；脈絡(luò)寧顆粒，江西銀濤藥業(yè)有限公司，批號(hào)1304015；月桂酸鈉，天津市博迪化工有限公司，批號(hào)20120529。

1.3 主要試劑與儀器

PR3（D-1）Antibody，美國Santacruz公司，貨號(hào)sc-74534；MPO測(cè)試盒，南京建成生物有限公司，貨號(hào)A044；LAMP-2（H-207）Antibody，美國Santacruz公司，貨號(hào)sc-5571；山羊抗兔IgG抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)公司，貨號(hào)PV-6001。紫外可見分光光度計(jì)，澳大利亞GBC公司；冰凍切片機(jī)，德國Leica公司；CX40光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

實(shí)驗(yàn)鼠基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、脈絡(luò)寧組和仙附溫陽通絡(luò)飲低、中、高劑量組（低、中、高劑量組），每組12只。

2.2 造模

參考文獻(xiàn)[3]方法，采用股動(dòng)脈注射月桂酸鈉溶液方法造模：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，向右后肢股動(dòng)脈遠(yuǎn)心端注入0.1 mL濃度為10 g/mL月桂酸鈉溶液，假手術(shù)組注射生理鹽水。手術(shù)完畢后給予腹腔注射青霉素，以防感染。

2.3 給藥

假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水灌胃，脈絡(luò)寧組和低、中、高劑量組給予脈絡(luò)寧溶液和不同劑量仙附溫陽通絡(luò)飲溶液灌胃。根據(jù)人與大鼠單位體質(zhì)量折算系數(shù)計(jì)算原藥材含量，其中脈絡(luò)寧溶液含原藥材0.27 g/mL，低、中、高劑量組給予仙附溫陽通絡(luò)飲溶液0.734、1.467、2.934 g/mL，中劑量組原藥材含量相當(dāng)于臨床成人用藥量。給藥體積10 mL/（kg·d），連續(xù)15 d。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采集血液標(biāo)本，EDTA抗凝，4 ℃、3000 r/min離心6 min，取上清液分裝，按MPO測(cè)試盒于說明進(jìn)行樣本前處理，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清對(duì)照管及測(cè)定管的光密度（OD值），并計(jì)算MPO活性[（測(cè)定OD值-對(duì)照OD值）÷11.3×取樣中所含血清量]。

患肢分離后取月桂酸注射處以下部位的股動(dòng)脈及周圍肌肉組織，置于4%多聚甲醛固定，待組織被完全浸透后取出室溫晾干，經(jīng)二甲苯透明、梯度乙醇組織復(fù)水、抗原修復(fù)、石蠟包埋切片，行組織化學(xué)染色、脫水封片等常規(guī)免疫組化方法處理后，于鏡下觀察大鼠股動(dòng)脈及周圍組織PR3、LAMP-2蛋白表達(dá)變化，并拍照留存，應(yīng)用ImagePro Plus6.0軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 仙附溫陽通絡(luò)飲對(duì)模型大鼠血清中髓過氧化物酶活性的影響

與假手術(shù)組比較，大鼠造模后血清中MPO活性升高（P<0.01），說明TAO造模成功。與模型組比較，各給藥組MPO活性降低（P<0.05，P<0.01），其中，中劑量組下降最明顯。結(jié)果見表1。

4.2 仙附溫陽通絡(luò)飲對(duì)模型大鼠股動(dòng)脈及周圍組織中蛋白酶3、溶酶體相關(guān)膜蛋白-2蛋白表達(dá)的影響

高倍鏡下觀察，模型組大鼠股動(dòng)脈及周圍組織中PR3、LAMP-2蛋白表達(dá)增加，主要集中于中性粒細(xì)胞的胞漿內(nèi)，圍繞在細(xì)胞核周圍，見圖1、圖2。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PR3、LAMP-2蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中、高劑量組PR3、LAMP-2蛋白表達(dá)量降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

5 討論

TAO的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，但免疫學(xué)方面的研究進(jìn)展提示該病的發(fā)生存在體液免疫功能的異常[4]。其中ANCA被廣泛認(rèn)為在TAO發(fā)病機(jī)制中起重要作用，是臨床檢驗(yàn)常用的重要指標(biāo)之一[5]。迄今為止，已有10余種中性粒細(xì)胞胞漿成分被證實(shí)為ANCA的靶抗原，其中較為經(jīng)典的是MPO和PR3[6]。研究表明，LAMP-2在細(xì)胞黏附、抗原遞呈和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用[7]。盡管ANCA的抗原種類繁多，但不同的抗原系統(tǒng)與不同的疾病發(fā)生相關(guān)，迄今為止，大多數(shù)學(xué)者研究認(rèn)為，TAO的發(fā)生與MPO、PR3和LAMP-2密切相關(guān)。

中醫(yī)認(rèn)為，肝腎虧虛、精血不足是脫疽發(fā)生的重要因素，臨床以溫陽通絡(luò)為基本治療法則。仙附溫陽通絡(luò)飲以附子、淫羊藿為君藥，以黃芪、肉桂、黨參、赤芍等為臣藥，立旨于溫腎散寒、活血行氣、通絡(luò)止痛?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中君藥附子能顯著增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，調(diào)節(jié)體液免疫中各種免疫球蛋白代謝，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[8]；淫羊藿中的主要化學(xué)成分淫羊藿總黃酮亦可通過直接增加免疫細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌淋巴因子，提高體液免疫和細(xì)胞免疫能力，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力[9]；臣藥黃芪能提高免疫球蛋白的分泌和排泄、促進(jìn)抗體產(chǎn)生、對(duì)B淋巴細(xì)胞免疫功能具有明顯的增強(qiáng)作用[10]?？v觀全方，仙附溫陽通絡(luò)飲可以通過直接影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝或誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)體液因子等途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，TAO模型大鼠血清中MPO活力、股動(dòng)脈血管及周圍肌肉組織中PR3和LAMP-2蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道的MPO、PR3和LAMP-2抗原與TAO發(fā)生有關(guān)相符。與模型組比較，各給藥組上述指標(biāo)均不同程度降低（P<0.05），中劑量組治療后效果最為顯著（P<0.01）。表明臨床劑量仙附溫陽通絡(luò)飲對(duì)月桂酸所致的TAO模型大鼠具有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能與降低ANCA相關(guān)抗原水平、進(jìn)一步抑制體液免疫功能亢進(jìn)相關(guān)。

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（收稿日期：2014-12-11；編輯：華強(qiáng)）