商俊芳等

摘要：目的 觀察子午流注納甲法對(duì)急性缺血性腦卒中（AIS）模型大鼠血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、S100B蛋白含量的影響。方法 選用SPF級(jí)SD雄性大鼠，采用大腦中動(dòng)脈線栓法建立模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、循經(jīng)組和納甲組，空白組、假手術(shù)組和模型組不作治療，循經(jīng)組予循經(jīng)辨證取穴針刺治療，納甲組予子午流注納甲法針刺治療，每日定時(shí)治療1次，觀察神經(jīng)功能及腦梗死體積情況，檢測(cè)血清NSE、S100B蛋白的含量。結(jié)果 與模型組比較，循經(jīng)組、納甲組神經(jīng)功能評(píng)分下降、梗死灶體積減小、梗死灶體積百分比降低（P<0.05，P<0.01），血清NSE、S100B蛋白含量降低（P<0.05，P<0.01），納甲組效果總體優(yōu)于循經(jīng)組。結(jié)論 子午流注納甲法通過(guò)降低AIS模型大鼠血清NSE、S100B蛋白含量達(dá)到神經(jīng)保護(hù)和治療作用。

關(guān)鍵詞：子午流注納甲法；急性缺血性腦卒中；S100B蛋白；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；大鼠

中圖分類號(hào)：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）06-0054-04

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke， AIS）發(fā)病率、病死率、致殘率較高。近年來(lái)，隨著飲食結(jié)構(gòu)及行為方式的變化，加之社會(huì)人口老齡化進(jìn)程加劇，AIS發(fā)病率逐年升高，選擇一種有效治療方案及時(shí)救治，是改善預(yù)后、提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。筆者應(yīng)用子午流注納甲法針刺治療AIS患者，療效較好[1]。腦缺血后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的壞死和血腦屏障的破壞使神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和S100B蛋白從腦組織溢出到血管腔隙[2]，其血清中水平變化能夠反映腦損傷程度及疾病預(yù)后。因此，本研究觀察子午流注納甲法對(duì)AIS模型大鼠血清中NSE、S100B蛋白的影響，為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康成年SD雄性大鼠60只，3月齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（甘）2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前8 h禁食。所有動(dòng)物按體質(zhì)量編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表法分組，抽取12只為空白組，12只為假手術(shù)組，其余進(jìn)行造模。符合納入標(biāo)準(zhǔn)的造模成功大鼠再分成模型組、循經(jīng)組、納甲組，每組12只。

1.2 針具與儀器

華佗牌25 mm×0.32 mm美容針灸針，蘇州針灸器械廠。BP-1215型Sartorius分析天平，北京多利斯天平有限公司；TLS-2000A型電子秤，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；TCG-16B型臺(tái)式低速離心機(jī)，上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠；DW-86L828型超低溫冰箱，中國(guó)海爾公司；CMIAS-108型多媒體病理圖像分析儀，北京航空航天大學(xué)研制。氯化2，3，5-三苯基四氮唑（TTC），化學(xué)純，北京福星化工廠；NSE、S100B蛋白試劑盒，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 造模

參考文獻(xiàn)[3]方法，大腦中動(dòng)脈線栓法制備大鼠AIS模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠板上，剪除頸部毛發(fā)并消毒，在頸部正中縱行切長(zhǎng)約2 cm的開(kāi)口，鈍性分離皮下筋膜、肌肉，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）及分支頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA），游離右側(cè)CCA，分別在CCA近心端、ECA及CCA遠(yuǎn)心端掛線備用，用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。在CCA上距分叉部4 mm處剪一小口，將備用栓線插入至ICA，扎緊CCA遠(yuǎn)心端的線以固定栓線，松開(kāi)動(dòng)脈夾，直至遇到少許阻力為止，從CCA分叉部起插入深度約為18～19 mm，術(shù)畢檢查無(wú)活動(dòng)性出血后，將線頭置于體內(nèi)，縫合皮膚。整個(gè)手術(shù)過(guò)程中環(huán)境溫度（25.0±1.0）℃，保證大鼠生命體征穩(wěn)定。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。假手術(shù)組處理方法同上，但不插線栓，僅分離右側(cè)CCA、ICA及ECA。大鼠麻醉清醒后，進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分，1～3分為造模成功，用于實(shí)驗(yàn)，0分及昏迷不醒者剔除并補(bǔ)充。

1.4 治療

大鼠清醒后當(dāng)日開(kāi)始治療，每日同一時(shí)間治療1次，直至處死動(dòng)物為止。空白組、假手術(shù)組和模型組每日只進(jìn)行相同抓取，同期同步飼養(yǎng)，不作任何治療。參照文獻(xiàn)[4-5]穴位定位或類比取穴。循經(jīng)組循經(jīng)辨證選取“百會(huì)”向后斜刺、“合谷”直刺、“三陰交”直刺。納甲組在循經(jīng)辨證取穴基礎(chǔ)上根據(jù)文獻(xiàn)記載徐氏子午流注納甲法[6]，依日按時(shí)開(kāi)穴針刺治療，所開(kāi)穴位為主穴先刺，循經(jīng)辨證取穴為配穴后刺。每次留針20 min，針刺深度依穴位而定，均采用平補(bǔ)平瀉法。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 一般情況及神經(jīng)功能 每日觀察所有大鼠的精神狀態(tài)、皮毛光澤及亮度、自主活動(dòng)、肢體運(yùn)動(dòng)、攝食情況、體質(zhì)量變化。采用改良Bederson[7]及Longa[3]的方法進(jìn)行4分制行為功能評(píng)分。0分：無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：不能完全伸展左側(cè)（癱瘓側(cè)）前肢，提鼠尾離開(kāi)地面30 cm，左前肢表現(xiàn)為腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或兼而有之；2分：行走時(shí)，大鼠向左側(cè)（癱瘓側(cè)）轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)，大鼠身體向左側(cè)（癱瘓側(cè)）傾倒或輕推肩部時(shí)即向左側(cè)傾倒；4分：不能自行行走或意識(shí)喪失。

1.5.2 血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100B蛋白含量測(cè)定 治療7 d后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，股動(dòng)脈采血5 mL，注入離心管中，待凝固后（30～40 min），3000 r/min離心10 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱備測(cè)。NSE、S100B蛋白含量采用ELISA測(cè)定，按照試劑盒使用說(shuō)明操作。

1.5.3 腦梗死體積測(cè)定 采血后大鼠迅速斷頭處死，打開(kāi)顱骨取腦，用生理鹽水沖洗后，放入-20 ℃冰箱中冰凍至適當(dāng)硬度（約15 min）。取速凍大鼠腦組織，在視交叉處從枕極到額極冠狀位切腦，其后間隔2 mm連續(xù)做6個(gè)冠狀切片，放入2%TTC液中，37 ℃水浴箱中避光孵育20 min（10 min翻面）染色，正常腦組織染為玫瑰紅色，腦梗死區(qū)不染色（白色），濾除TTC液，置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，腦片按腦的前后順序整齊排列保存。數(shù)碼照相機(jī)拍照后輸入計(jì)算機(jī)，采用圖像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算每個(gè)層面梗死灶面積，將梗死灶面積乘以層厚（2 mm），得出每個(gè)層面的梗死灶體積，各層面的梗死灶體積相加即得出整個(gè)腦組織的梗死灶體積，同時(shí)計(jì)算前腦總體積及腦梗死范圍占同側(cè)大腦百分比（%）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以—x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)用t檢驗(yàn)），多組間比較采用方差分析及q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及神經(jīng)功能評(píng)定

手術(shù)大鼠均于術(shù)后1 h內(nèi)清醒，假手術(shù)組較早出現(xiàn)攝食活動(dòng)。造模大鼠均于術(shù)后2～3 d內(nèi)出現(xiàn)活動(dòng)減少，一般情況較差，精神萎靡喜臥，閉目不喜睜眼，反應(yīng)遲鈍，食欲減退，毛發(fā)枯燥無(wú)光澤，肌肉瘦削，體重減輕，3 d后自主活動(dòng)增加，皮毛光澤及亮度漸好轉(zhuǎn)，精神狀態(tài)亦有明顯改善，體質(zhì)量增加，納甲組整體狀況恢復(fù)較模型組和循經(jīng)組快。空白組及假手術(shù)組大鼠活動(dòng)正常，無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能評(píng)分為0分。術(shù)后3 h，循經(jīng)組及納甲組神經(jīng)功能評(píng)分與模型組比較略下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后3 d，納甲組神經(jīng)功能評(píng)分與模型組比較明顯下降（P<0.05，P<0.01）。納甲組與循經(jīng)組神經(jīng)功能評(píng)分比較各時(shí)點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 子午流注納甲法對(duì)大鼠梗死灶體積的影響

空白組及假手術(shù)組無(wú)梗死灶形成。造模大鼠梗死側(cè)大腦半球水腫明顯，體積明顯大于對(duì)側(cè)，經(jīng)TTC染色后，均在梗死側(cè)大腦皮層出現(xiàn)邊界清晰、范圍恒定的蒼白梗死灶，提示造模理想。循經(jīng)組及納甲組梗死灶體積均較模型組減小，納甲組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。循經(jīng)組及納甲組梗死灶體積百分比較模型組降低（P<0.05，P<0.01），2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；腦梗死體積百分比較模型組下降（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 子午流注納甲法對(duì)大鼠血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100B蛋白含量的影響

與空白組比較，造模大鼠血清中NSE、S100B蛋白含量明顯升高（P<0.01）；循經(jīng)組及納甲組血清中NSE、S100B蛋白含量較模型組降低（P<0.01），2組比較NSE含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

AIS屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，多由于氣血逆亂，導(dǎo)致腦脈痹阻或血溢于腦，以昏仆、半身不遂、肢麻、舌蹇等為主要臨床表現(xiàn)。有研究表明，AIS發(fā)病存在著晝夜節(jié)律性差異，并認(rèn)為導(dǎo)致晝夜發(fā)病時(shí)間有規(guī)律的原因，可用人體生物鐘及內(nèi)環(huán)境變化來(lái)解釋[8]，其發(fā)病存在著24 h時(shí)間節(jié)律差異，上午6-12時(shí)發(fā)病率較高，其中6-10時(shí)為最高時(shí)間段，應(yīng)用圓形分布法分析，其平均發(fā)病的高峰時(shí)點(diǎn)為8點(diǎn)21分。此時(shí)間段加上時(shí)差因素正為卯、辰、巳時(shí)，當(dāng)大腸、胃、脾主時(shí)；最高時(shí)間段正當(dāng)手足陽(yáng)明經(jīng)主時(shí)；高峰時(shí)點(diǎn)正為辰時(shí)，足陽(yáng)明胃經(jīng)主時(shí)[9]。子午流注針?lè)ㄊ前凑杖梭w氣血虛衰的周期性，從而應(yīng)對(duì)自然界變化，采取逐日按時(shí)開(kāi)穴的針灸治療方法，突出強(qiáng)調(diào)了時(shí)間因素對(duì)針灸效應(yīng)的影響，能夠起到調(diào)和氣血、補(bǔ)虛瀉實(shí)、平衡陰陽(yáng)的作用。

目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，缺血性腦損傷后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受到損害，大量的胞漿蛋白質(zhì)漏出細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞間液，可溶性的物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞間液進(jìn)入腦脊液，穿過(guò)破壞的血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)?？梢栽O(shè)想，檢測(cè)血清中與腦損傷有關(guān)的生物學(xué)物質(zhì)可用來(lái)監(jiān)測(cè)腦卒中的嚴(yán)重程度，了解患者的神經(jīng)功能恢復(fù)情況及治療效果，并且有可能判斷患者的預(yù)后。S100蛋白是腦的特異性蛋白，因其表達(dá)水平與各種原因引起的腦損傷有緊密聯(lián)系，已被作為評(píng)價(jià)腦損傷的一個(gè)指標(biāo)。NSE是神經(jīng)元損傷最敏感的生化指標(biāo)，能夠反映腦損傷的程度，被認(rèn)為是神經(jīng)元損傷的標(biāo)志酶，且為最靈敏的生化指標(biāo)，其水平變化能夠反映神經(jīng)元損傷程度及疾病預(yù)后[10]。NSE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用尚未明了，但一些實(shí)驗(yàn)研究顯示，其具有神經(jīng)保護(hù)作用，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中參與膜結(jié)構(gòu)形成并參與所有能量依賴性細(xì)胞過(guò)程[11]。另外，NSE是維持神經(jīng)元細(xì)胞膜興奮性的必需成分，與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控有關(guān)，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。檢測(cè)其在血清中的含量，對(duì)腦損傷的早期診斷、判斷嚴(yán)重程度及針刺的影響、預(yù)后評(píng)估具有一定價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型大鼠神經(jīng)功能缺損，梗死側(cè)大腦半球水腫明顯，體積明顯大于對(duì)側(cè)，經(jīng)TTC染色后，均在梗死側(cè)大腦皮層出現(xiàn)邊界清晰、范圍恒定的蒼白梗死灶，線栓法建立AIS模型的造模方法可靠恒定，與手術(shù)創(chuàng)傷無(wú)關(guān)。AIS模型大鼠經(jīng)針刺治療后，一般情況及神經(jīng)功能明顯恢復(fù)，梗死灶體積百分比顯著下降，腦梗死體積明顯縮小，同時(shí)降低血清中NSE、S100B蛋白的含量，子午流注納甲法效果更加顯著，優(yōu)于循經(jīng)辨證治療。對(duì)AIS模型大鼠進(jìn)行針刺治療，可加速腦側(cè)支循環(huán)的建立，增加腦血流量，改善腦的氧代謝，保護(hù)神經(jīng)元，減少腦神經(jīng)元的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，減輕缺血后的繼發(fā)損傷，降低血清中NSE、S100B蛋白的含量，維持了神經(jīng)元細(xì)胞膜興奮性，減少神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞破壞，降低神經(jīng)炎性反應(yīng)，起到神經(jīng)保護(hù)作用，修復(fù)被破壞的腦細(xì)胞及腦血管，促進(jìn)損傷的中樞神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，重建損傷的血腦屏障，維護(hù)血腦屏障正常的通透性，縮小腦梗死體積，起到治療作用，這可能是針刺治療AIS患者療效的機(jī)制之一。子午流注納甲法更能順應(yīng)AIS發(fā)病晝夜節(jié)律性差異與人類的生物鐘有關(guān)的特點(diǎn)，依“陽(yáng)日陽(yáng)時(shí)開(kāi)陽(yáng)經(jīng)之穴，陰日陰時(shí)開(kāi)陰經(jīng)之穴”的原則，于每日辰時(shí)或巳時(shí)納甲法按時(shí)開(kāi)穴針刺，因而更利于疾病的治療。

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（收稿日期：2014-08-02）

（修回日期：2014-08-26；編輯：華強(qiáng)）