譚麗萍等

【摘 要】 目的：利用高脂飼料建立非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，為非酒精性脂肪肝的中藥治療效果提供基礎(chǔ)。方法：將70只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為2組，即正常組20只、模型組50只，正常組隨機(jī)分為5組，每組4只；模型組隨機(jī)分為5組，每組10只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)。于第四周、第六周、第八周、第十周、第十二周分別處死1組正常組和1組模型組。觀察大鼠肝臟大體觀，稱量肝臟濕重，計(jì)算大鼠肝體比，并將肝臟進(jìn)行石蠟切片HE染色和冰凍切片蘇丹三染色。 結(jié)果：從第四周末開始，模型組大鼠肝濕重增高，與正常組大鼠肝濕重比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并在第六周末、第十周末、第十二周末出現(xiàn)顯著差異。從第六周末開始模型組肝指數(shù)增高與正常組肝指數(shù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟鏡下觀從第四周開始出現(xiàn)輕度脂肪肝，并隨著造模時(shí)間的延長，不斷加重。結(jié)論：利用常規(guī)高脂飼料（88%普通飼料中加入10%豬油和2%膽固醇）造非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，于造模后第四周即出現(xiàn)非酒精性脂肪肝，并隨著時(shí)間延長不斷加重。

【關(guān)鍵詞】 高脂；非酒精性脂肪肝；模型

【中圖分類號(hào)】R965.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）13-0014-04

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）俗稱脂肪肝，是指以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性為病理特征而無過量飲酒史及其他肝病的臨床綜合征，其病理類型包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）及NASH相關(guān)肝硬化，后者可發(fā)展為肝癌[1-2]。隨著生活水平的不斷提高，人們從飲食中攝取的高脂物質(zhì)越來越多，出行交通便利，工作壓力大，運(yùn)動(dòng)量減少，導(dǎo)致其發(fā)病率逐年上升。課題組致力研究活血化瘀方對(duì)非酒精性肝病的治療效果，成功建立了NAFLD的模型，為今后的治療研究提供了良好地基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重（100±10）g，70只。購自四川省成都達(dá)碩生物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2014-23。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器以及試劑 豬油自制；膽固醇（批號(hào)：20130201，安徽天啟化工科技有限公司）；YP10002 電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；YD1508B輪式切片機(jī)（浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠）；HI1220 烘片機(jī)（德國 LEICA 公司）；HI1210 攤片機(jī)（德國 LEICA 公司）；CM1860UV冷凍切片機(jī)（德國 LEICA 公司）

1.3 高脂飼料的配制[3] 88%普通飼料中加入10%豬油和2%膽固醇。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 將70只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組，即正常組20只、模型組50只，正常組隨機(jī)分為5組，每組4只；模型組隨機(jī)分為5組，每組10只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)。各組自由飲水。

1.5 處理方法 大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，次日以10%水合氯醛溶液0.25ml/100g進(jìn)行腹腔注射麻醉。取血后，處死大鼠，迅速取肝組織稱重。后將肝臟浸泡于10%中性福爾馬林內(nèi)固定，進(jìn)行石蠟切片和冰凍切片。

1.6 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.6.1 脂肪肝病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[4] 低倍鏡下，肝細(xì)胞脂肪變性占肝小葉1/3～1/2者為輕度脂肪肝；占肝小葉1/2～3/4者為中度脂肪肝；占肝小葉3/4以上或者肝細(xì)胞彌漫脂肪性變性呈漁網(wǎng)狀者為重度脂肪肝。

1.6.2 肝指數(shù)的測定[4] 動(dòng)物處死后，立即取肝臟，濾紙吸干表面水分后稱其濕重，計(jì)算肝指數(shù)：肝指數(shù)=肝臟重量（g）/體重（g）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重、肝濕重以及肝指數(shù)變化情況 由表1可知，隨著時(shí)間的延長，大鼠體重在不斷增加，但各時(shí)間段正常組和模型組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從第四周末開始，模型組大鼠肝濕重增高，與正常組大鼠肝濕重比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并在第六周末、第十周末、第十二周末出現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；從第六周末開始模型組肝指數(shù)增高與正常組肝指數(shù)對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 肝臟病理學(xué)變化

2.2.1 肝臟肉眼觀察結(jié)果 正常組大鼠肝臟顏色為均勻的暗紅色，邊緣銳利，質(zhì)韌。模型組肝臟體積明顯增大，顏色呈現(xiàn)紅黃相間，并隨著時(shí)間的延長肝臟顏色越來越白，邊緣變圓鈍，包膜緊張，質(zhì)地變脆。見圖1。

2.2.2 肝臟鏡下觀察

2.2.2.1 不同造模時(shí)間各個(gè)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肝臟脂肪變性情況 正常組大鼠肝臟全部正常，沒有發(fā)生脂肪變性，第四周模型組大鼠肝臟輕度脂肪肝占100%；第六周模型組輕度脂肪肝占10%，中度脂肪肝占80%，重度脂肪肝占10%；第八周模型組輕度脂肪肝占10%，中度脂肪肝占20%，重度脂肪肝占70%；第十周模型組中度脂肪肝占10%，重度度脂肪肝占90%；第十二周模型組重度脂肪肝占100%。具體見表2。

2.2.2.2 肝臟病理組織學(xué)描述 各周次正常肝組織石蠟切片HE染色、冰凍切片蘇丹三染色鏡下結(jié)構(gòu)均正常，肝血竇清晰，肝索以中央靜脈為中心呈現(xiàn)放射狀，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。見圖2

石蠟切片HE染色，第四周模型組肝組織、肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量的微小的脂肪空泡，肝索、肝血竇較清晰；第六周模型組肝組織、肝細(xì)胞出現(xiàn)中度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)中等量大小不等的空泡，肝細(xì)胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失；第八周模型組肝組織、肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)有大量大小不等的脂滴，肝細(xì)胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失；第十周、十二周模型組肝組織、肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)有大量大小不等的脂滴，肝細(xì)胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失，并伴隨肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死和少量炎細(xì)胞的浸潤。見圖3。

冰凍切片蘇丹三染色，第四周模型組肝組織、肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量的橘紅色的脂滴，肝索、肝血竇較清晰；第六周模型組肝組織、肝細(xì)胞出現(xiàn)中度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)中等量橘紅色的脂滴，肝細(xì)胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失；第八周模型組肝組織、肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)有大量橘紅色的脂滴，肝細(xì)胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失；第十周，第十二周模型組肝組織、肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)有大量大小不等的脂滴，肝細(xì)胞體積增大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死。見圖4。

3 討論

隨著非酒精性脂肪肝的發(fā)病率逐年升高，科研工作者對(duì)該疾病的研究越來越多，如何建立與人類疾病特征相似的非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，是研究該疾病的首要問題。建立非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型的方法很多，動(dòng)物模型飼料配方有：高糖飲食，80%普通飼料+ 20% 蔗糖[4]；高脂飲食，在基礎(chǔ)飼料中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01的膽固醇，0.1的豬油，0.1的蛋黃粉，0.002的膽鹽[6]；改良高脂飼料，膽固醇2%，膽酸鈉05%，丙硫氧哮吮0.2%，蔗糖5%，豬油10%，基礎(chǔ)飼料82.3%[3] 等。理想的動(dòng)物模型應(yīng)當(dāng)具備以下條件：與人類疾病特征相似；病變有一定發(fā)展過程，與人類發(fā)病過程接近；形成率高，死亡率低，重復(fù)性好；造模方法簡便易行[5]。本實(shí)驗(yàn)所采用的常規(guī)高脂飼料（88%普通飼料中加入10%豬油和2%膽固醇），配方簡單，于第四周開始肝組織出現(xiàn)輕度的脂肪變性，成功的建立了非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，為后續(xù)非酒精性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Farrell GC， Chitturi S， Lau GK， et al. Asia-Pacific Working Party on NAFLD. Guidelines for the assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease in the Asia-Pacific region：executive summary [J]. J Gastroenterol Hepatol，2007，22：775-777.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南[J].中華肝臟病雜志，2006，14（1）：161-163.

[3] 王倩，管小琴.大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改進(jìn)[J].世界華人消化雜志，2007，15（11）：1219-1224.

[4] 劉嵩，盧笑叢，葛建，等.高脂所致脂肪肝動(dòng)物模型建立的動(dòng)態(tài)研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（11）：1399-1403.

[5] 蘇琳，劉玉蘭.高糖飲食及高脂飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型的比較[M].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2009，26（3）：14-17.

[6] 中國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[S].2003：35.

（收稿日期：2015.05.20）