張喆 唐明敏 范瑞艷 蔡大任 楊文寧 劉洋

摘要：目的 以序貫代謝思想為指導(dǎo)，研究銀杏葉片劑成分體內(nèi)代謝動態(tài)情況。方法 以在體大鼠封閉腸環(huán)法為研究手段，結(jié)合色譜指紋圖譜，對銀杏葉片劑經(jīng)過口服消化系統(tǒng)空間順序代謝，即腸道菌群、腸壁細胞及肝代謝后的入血成分譜進行考察及對比研究。結(jié)果 對可檢測到的色譜峰分析顯示，銀杏葉片劑有12個色譜峰在腸道內(nèi)被腸道菌群代謝，經(jīng)腸壁代謝產(chǎn)生7個色譜峰，銀杏葉片劑中的成分大部分被肝代謝，3個原藥色譜峰以原型入血。結(jié)論 本研究對銀杏葉片劑在口服途徑不同代謝部位的情況進行了定性描述，可為該制劑的質(zhì)量控制、機制闡述及再次開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物片劑；序貫代謝；肝代謝；腸道菌群代謝；腸壁代謝；指紋圖譜；封閉腸環(huán)法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.022

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0078-05

Sequential Metabolism Study on Ginkgo Folium Tablet in Digestive System ZHANG Zhe， TANG Ming-min， FAN Rui-yan， CAI Da-ren， YANG Wen-ning， LIU Yang （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

Abstract：Objective To investigate dynamic metabolism in vivo of Ginkgo Folium Tablet under the guidance of sequential metabolism thoughts. Methods In situ closed-loop in rats was carried out to study sequential metabolism of Ginkgo Folium Tablet through oral digestive system， namely to investigate and compare the intestinal flora metabolism， the gut wall metabolism and hepatic metabolism， combined with chromatographic fingerprint of blood samples. Results The analysis showed that 12 peaks in Ginkgo Folium Tablet were metabolized by intestinal flora， and 7 peaks generated through the gut wall. Most components of Ginkgo Folium Tablet were metabolized in liver， and 3 original medicine components were directly into the blood. Conclusion This study conducts a qualitative description of metabolism of Ginkgo Folium Tablet in different parts of the oral route， and provides references for the quality control， mechanism explanation and secondary development for Ginkgo Folium Tablet.

Key words：Ginkgo Folium Tablet；sequential metabolism；hepatic metabolism；intestinal flora metabolism；gut wall metabolism；fingerprint；in situ closed-loop

序貫代謝，是指以口服藥物在體內(nèi)的空間順序為依托，分別對藥物在腸道內(nèi)的腸道菌群代謝、腸壁酶代謝、肝代謝進行系統(tǒng)研究，考察藥物成分的體內(nèi)代謝歷程，為藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選及其作用靶點的研究奠定基礎(chǔ)[1]。銀杏葉提取物片劑藥效藥理作用研究較明確[2]，該制劑有良好的治療心腦血管及中樞疾病

基金項目：北京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生科研課題質(zhì)量工程項目（201310026071）

通訊作者：劉洋，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn

藥效[3]。本試驗以銀杏葉片劑為研究對象，以序貫代謝為研究思路，結(jié)合色譜指紋圖譜實現(xiàn)多成分同時檢測，對口服銀杏葉片劑成分在消化道內(nèi)的代謝情況進行考察[4]，并對其原藥成分與代謝產(chǎn)物進行分析與推測，為該制劑的二次開發(fā)提供參考。

1 儀器、試藥與動物

Waters液相色譜系統(tǒng)（600 四元泵，美國Waters公司），2487雙波長紫外檢測器，Empower 2工作站；離心機（1-15PK，德國西格瑪公司），漩渦混合儀（VX-200，深圳市賽泰克生物科技有限公司），恒溫水浴鍋（HH-2，江蘇省金壇市晨陽電子儀器廠），制氧機（氧立得，北京市皓月樓工貿(mào)有限責(zé)任公司），超聲波清洗器（KQ5200E，北京中晟銘科技有限公司），蠕動泵（BT100-1F，保定蘭格恒流泵有限公司）。

銀杏葉片劑（銀杏葉提取物片），德國威瑪舒培博士藥廠，批號4330213；酶抑制劑（1-氨基苯并三唑），北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司。Krebs-Henseleit液（自制）；乙腈（色譜純），美國Fisher公司；純凈水；其余試劑均為分析純。

SPF級健康雄性SD大鼠，9周齡，體質(zhì)量（300±20）g，北京斯貝福實驗動物科技有限公司，合格證號SCXK（京）2011-0004。飼養(yǎng)于符合國家標(biāo)準的屏障環(huán)境中，室溫22～24 ℃，相對濕度60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以上，自由飲水和進食。

2 方法

2.1 藥物制備

取銀杏葉片劑10片，去除包衣后，研成粉末，精密稱取200 mg，加水30 mL，超聲（功率200 W，頻率40 kHz） 20 min，過濾，濾液濃縮為1 mL，得銀杏葉提取物，放置，待用。

2.2 人工血液灌流液制備

抗凝后的牛血3000 r/min離心10 min，棄上清液，加生理鹽水洗滌3次以上至上清液不紅即可，得洗滌牛紅細胞。人工血液灌流液為含有20%牛紅細胞、2.2%右旋糖酐、1%氨基酸、6%葡萄糖的Krebs- Henseleit緩沖液，并在輸血前供氧[5]。

2.3 在體封閉腸環(huán)法研究序貫代謝

2.3.1 腸道菌代謝考察 大鼠禁食24 h，自由飲水，稱重，麻醉，剪開腹部，選擇為盲腸以下8 cm長腸段，將銀杏葉提取物注入腸腔，當(dāng)藥液到達腸段末端，用絲線結(jié)扎，取下注射器并結(jié)扎進口端腸段。從頸靜脈開始輸血，同時在腸系膜靜脈采血，流速0.5 mL/min，1 h后處死大鼠[6-8]。

2.3.2 腸壁細胞代謝考察 手術(shù)方法同“2.3.1”項，腸段用生理鹽水沖洗干凈腸內(nèi)容物，注入銀杏葉提取物，同法采集血樣。另一只大鼠同樣按“2.3.1”項下方法手術(shù)，腸段沖洗干凈后注入含1 mg酶抑制劑的銀杏葉提取物。

2.3.3 肝代謝考察 手術(shù)方法同“2.3.1”項，將銀杏葉提取物注入腸腔后放回腹腔內(nèi)，1 h后腹主動脈采全血。

2.4 血樣處理

血液樣品于4 ℃、9000 r/min離心10 min，吸取上清液，加3倍量甲醇渦旋2 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，減壓濃縮后過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，供高效液相色譜（HPLC）分析。

2.5 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil C18（ODS-2）柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0→11 min，13%→20%B；11→17 min， 20%→21%B；17→34 min，21%→25%B；34→44 min， 25%→30%B；44→54 min，30%→75%B）；流速1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：360 nm；進樣量：20 μL。

3 結(jié)果

3.1 銀杏葉片腸道菌代謝情況

經(jīng)腸道菌群代謝后，血樣中檢測到14個色譜峰，與原藥指紋圖譜比較，峰2、9、12、14、16、17、29共7個色譜峰可直接進入血液，峰1、6、10、11、21、22、23、24、25、28、30、31共12個原色譜峰可能在腸道內(nèi)被腸道菌代謝，并且腸道菌群代謝后產(chǎn)生7個新峰，其中峰X5、X7為腸壁代謝產(chǎn)物，色譜圖見圖1。

3.2 腸壁代謝情況

腸壁細胞內(nèi)存在的藥物代謝酶主要為CYP450酶系，通過加入廣譜型酶抑制劑前后血液圖譜的對比可推測藥物成分在腸壁代謝的情況，色譜圖見圖2。圖中A與B對比可知，經(jīng)腸壁吸收共有25個色譜峰被檢出，其中18個為原藥色譜峰，7個新色譜峰（X1～X7）；加入廣譜型酶抑制劑后，B、C對比可認為原藥峰3、13在吸收過程中被腸壁細胞酶代謝。峰X2、X4加入酶抑制劑后未在血樣里檢測到，推測該成分為被抑制的腸壁酶代謝產(chǎn)物。峰X1、X3、X5、X6、X7在加入酶抑制劑后仍出現(xiàn)在血樣里，推測這幾個色譜峰可能為其他腸壁酶的代謝產(chǎn)物，未被該酶抑制劑抑制；此外，加入酶抑制劑后血樣中檢測出2個色譜峰，推測可能為其他腸壁酶的代謝產(chǎn)物，該酶與被抑制的酶存在競爭作用；色譜峰14、21、22、23、30共5個原藥峰在加入酶抑制劑后沒有吸收入血，推測其吸收可能與某些被代謝的成分存在相互作用。

3.3 肝代謝結(jié)果

經(jīng)過肝代謝后，在血液中檢測到13個色譜峰，腸道吸收后的成分大多數(shù)被肝代謝，原藥峰2、17被肝代謝，峰12、16、29未被肝代謝；峰X7可推測為腸道代謝與肝代謝的共同產(chǎn)物；明確檢出7個肝代謝產(chǎn)物，其中峰8、10、20、28可能在腸道菌代謝后又經(jīng)過肝轉(zhuǎn)化為原型，其他3個成分為肝代謝產(chǎn)物。色譜圖見圖3。

注：A.原藥；B.無腸道菌吸收代謝血樣；C.腸道菌吸收代謝血樣；D.空白血樣

圖1 腸道菌群代謝分析血樣指紋圖譜

注：A.原藥；B.無腸道菌腸吸收代謝血樣；C.加酶抑制劑腸吸收血樣；D.空白血樣

圖2 腸壁代謝分析血樣指紋圖譜

A.原藥；B.腸道菌腸吸收代謝血樣；C.肝代謝血樣；D.空白血樣

圖3 肝代謝分析血樣指紋圖譜

4 討論

本研究對銀杏葉片劑在口服途徑吸收代謝過程中不同代謝部位的情況進行了定性描述，可為該制劑的質(zhì)量控制、機制闡述及再次開發(fā)提供參考。如經(jīng)過肝代謝后仍以原形存在的色譜峰8、10、16、20、28、29可被遴選作為其質(zhì)量控制成分；被腸壁酶細胞代謝及被腸道菌代謝的原成分及代謝產(chǎn)物可進一步明確該藥藥效機制是否與腸壁酶或腸道菌有關(guān)聯(lián)；此外，入血的代謝產(chǎn)物可作為新的先導(dǎo)化合物的候選成分。

序貫代謝思想實現(xiàn)了對口服藥物體內(nèi)吸收代謝的空間順序的逐一研究，重點比較了不同代謝部位對藥物化學(xué)成分的處置，體現(xiàn)了口服藥物體內(nèi)過程的現(xiàn)實情況，為藥物體內(nèi)代謝研究提出了新思路。但是，藥物體內(nèi)代謝并非單純不同組織器官有序的處理，其分子機制的復(fù)雜性、空間上的連續(xù)性，以及時間上的并行性還有待于進一步研究，筆者研究團隊將在后續(xù)研究中體現(xiàn)。

此外，本試驗將中藥傳統(tǒng)的體外篩選轉(zhuǎn)變?yōu)轶w內(nèi)研究，只是對藥物化合物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化結(jié)果進行了定性表述，其機制仍需進一步探究。中藥的多成分是其體內(nèi)代謝研究重點和難點，指紋圖譜的建立雖然實現(xiàn)了多成分同時檢測，但只是其龐大成分群中的一部分內(nèi)容。同時，多成分體內(nèi)吸收代謝的相互作用等也需要考慮。目前的研究雖不能完全闡明中藥多成分在體內(nèi)的處置過程，但為其后續(xù)遞進式研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 劉洋，潘艷麗，王晶娟，等.多成分藥物代謝理論及技術(shù)方法分析[J].中草藥，2014，45（12）：1663-1667.