康學(xué)東 李菲 楊維杰 余臣祖

摘要：目的 觀察化濁顆粒對(duì)2型糖尿?。═2DM）大鼠磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）在骨骼肌組織中表達(dá)的影響，探討其對(duì)PI-3K及GLUT4信號(hào)通路激活的作用。方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射建立T2DM大鼠模型，隨機(jī)分為化濁顆粒組、羅格列酮組、模型組。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組與空白組予生理鹽水灌胃，觀察大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量及攝食量。干預(yù)10周后，予10%水合氯醛麻醉大鼠，檢測(cè)大鼠空腹血糖（FBG）、葡萄糖耐量試驗(yàn)餐后2 h血糖（2 h PG）、空腹胰島素（FINS）水平；RT-PCR檢測(cè)各組大鼠骨骼肌組織PI-3K和GLUT4 mRNA表達(dá)的水平。結(jié)果 與模型組比較，化濁顆粒組與羅格列酮組大鼠FBG、2 h PG及FINS水平降低（P<0.05），PI-3K及GLUT4 mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05）。結(jié)論 化濁顆粒具有提高胰島素敏感性的作用，與激活骨骼肌組織胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中PI-3K和GLUT4 mRNA的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：化濁顆粒；2型糖尿??；胰島素抵抗；磷脂酰肌醇3激酶；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.019

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）07-0067-04

Effects of Huazhuo Granule on Expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA in Rats with Type 2 Diabetes KANG Xue-dong1， LI Fei2， YANG Wei-jie1， YU Chen-zu2 （1.The Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China；2.Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Huazhuo Granule on expression of phosphatidylinositol-3-kinase （PI-3K） and glucose transporter 4 （GLUT4） in skeletal muscle type 2 diabetes （T2DM） rats；To discuss its effects on activating signal path of PI-3K and GLUT4. Methods High-fat diet combined with low-dose streptozotocin intraperitoneal injection was used to establish T2DM rat models. The rats were randomly divided into blank group， Huazhuo Granule group， rosiglitazone group， and model group. Each treatment group was given relevant medicine for gavage. Model group and blank control group were given normal saline for gavage. The general state， weight， and food ration of rats were observed. After ten-week medicine intervention， 10% chloral hydrate was used for anesthesia to detect the levels of FBG， OGTT （2 h PG）， and FINS. RT-PCR was used to detect the expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA of rat skeletal muscle in all groups. Results Compared with model group， the levels of FBG， 2 h PG， and FINS decreased （P<0.05）；the expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA of rat skeletal muscle increased significantly （P<0.05）. Conclusion Huazhuo Granule has the effects on increasing insulin sensitivity， which is related to activating insulin signal path of PI-3K and GLUT4 of skeletal muscle tissues.

Key words：Huazhuo Granule；type 2 diabetes；insulin resistance；PI-3K；GLUT4；rats

基金項(xiàng)目：甘肅省教育廳研究生導(dǎo)師科研項(xiàng)目計(jì)劃（1206-06）

通訊作者：李菲，E-mail：wowofiona@163.com

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（收稿日期：2014-12-13；編輯：華強(qiáng)）

2型糖尿病（T2DM）是一組由多原因引起的以慢性高血糖為特點(diǎn)的代謝性、系統(tǒng)性疾病，其病理機(jī)制是胰島素分泌不足/或胰島素抵抗（IR）。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，

IR是糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，不僅貫穿于T2DM的發(fā)生、發(fā)展的始末，同時(shí)也是導(dǎo)致T2DM各種合并癥的根源[1]?；瘽犷w粒是依據(jù)中醫(yī)濁毒理論組方的中藥復(fù)方制劑，前期研究表明，其可降低非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟指數(shù)、減輕非酒精性脂肪肝大鼠的IR[2-3]。本實(shí)驗(yàn)觀察化濁顆粒對(duì)T2DM大鼠骨骼肌組織胰島素信號(hào)通路中磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4） mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡述其改善IR的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)Wistar大鼠60只，4月齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK（甘）2011-0001。

1.2 藥物

化濁顆粒（黃連、黃柏、雞內(nèi)金、山楂、枳殼、丹參組成），甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑科提供，批號(hào)20130423；羅格列酮片，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，批號(hào)13010006。

1.3 主要試劑與儀器

10%水合氯醛，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；血清胰島素檢測(cè)試劑盒，上海麥約爾生物技術(shù)有限公司；SYBR Green，瑞士羅氏公司；Rnase-free水，北京百泰克生物科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒，中國寶生物工程（大連）有限公司；引物合成：大鼠PI-3K、GLUT4及β-actin基因特異性引物序列由中國寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)并合成。穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀，強(qiáng)生（中國）醫(yī)療器材有限公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國BD公司；C1000型PCR儀、CXF96型RT-熒光PCR儀，美國伯樂公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模

實(shí)驗(yàn)大鼠普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食、禁水12 h后尾部針刺采血，測(cè)定空腹血糖（FBG），血糖正常大鼠入選。將60只大鼠按體質(zhì)量標(biāo)號(hào)后，隨機(jī)抽出12只為空白組，繼續(xù)普通飼料飼養(yǎng)；余下48只造模組均喂以高脂飼料 （豬油10%，膽固醇2%，膽酸鹽0.5%，蔗糖20%，普通飼料67.5%）[4-5]。SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，自由飲水。4周后，造模組大鼠平均體質(zhì)量增加20%，可確定建模成功；成模大鼠隔夜禁食12 h，期間不禁水，將STZ現(xiàn)溶于pH4.4檸檬酸-檸檬酸三納緩沖液中，按30 mg/kg腹腔注射 [6-7]，連續(xù)3 d，建立T2DM大鼠模型。禁食、不禁水12 h，尾靜脈采血，測(cè)大鼠尾靜脈FBG；50%葡萄糖溶液2.5 g/kg灌胃，行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），測(cè)餐后2 h血糖（2 h PG），取FBG≥11.0 mmol/L、2 h PG≥16.7 mmol/L大鼠歸入模型組[8]，未達(dá)標(biāo)者均剔除。造模成功后，各組大鼠分籠，每籠3～4只，予因糖尿病大鼠飲水量增加，防止其水量不足，給予雙路喂水。將成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為化濁顆粒組、羅格列酮組、模型組。除空白組給予普通飼料外，其余組均給予高脂飼料。

2.2 給藥

按人與大鼠的體表面積之比換算成人所用藥量：化濁顆粒組每日予化濁顆?；鞈乙?.025 g/kg灌胃，羅格列酮組每日予羅格列酮混懸液0.36 mg/kg灌胃，灌胃體積1 mL/kg，空白組、模型組每日給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)10周。

2.3 一般情況觀察

觀察大鼠的一般狀態(tài)、自主活動(dòng)、精神狀態(tài)、體毛、色澤、飲水量、小便等。

2.4 體質(zhì)量及攝食量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前，電子天平測(cè)定大鼠體質(zhì)量，開始予高脂飼料喂養(yǎng)后，每周于同一時(shí)間段稱重1次，觀察大鼠生長、體質(zhì)量情況，依體質(zhì)量變化隨時(shí)調(diào)整灌胃量，至灌胃10周，最后1次給藥后禁食12 h，再對(duì)每只大鼠進(jìn)行稱重并記錄在攝食相似的情況下體質(zhì)量的變化。

2.5 血糖測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前全部大鼠隔夜禁食、禁水12 h后，尾部取血，測(cè)血糖1次。實(shí)驗(yàn)組予高脂飼料后，每周同一時(shí)間測(cè)大鼠血糖1次，直至灌胃結(jié)束。記錄高脂飲食及藥物灌胃后，各組大鼠血糖變化情況。

2.6 標(biāo)本采集和處理

藥物干預(yù)10周后，最后1次灌胃并禁食12 h后稱重，檢測(cè)大鼠尾靜脈FBG、OGTT 2 h PG，OGTT結(jié)束后，所有大鼠均禁食12 h，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，取血，測(cè)血清空腹胰島素（FINS）。并任取一側(cè)后肢骨骼肌，裝入凍存管，迅速凍存于液氮中，24 h后置于-80 ℃低溫冰箱保存，備用。

2.7 RT-PCR檢測(cè)大鼠骨骼肌組織磷脂酰肌醇3激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4基因表達(dá)

2.7.1 骨骼肌總RNA的提取 取超低溫凍結(jié)骨骼肌組織約5 mg，加入200 ?L Trizol，剪碎組織，再加約1000 ?L Trizol，加入液氮，充分勻漿，靜置后離心，加入氯仿，吸取上清液，將其移入新的EP管中，加入氯仿約240 ?L，冰上靜置5 min， 4 ℃、12 000 r/min離心15 min；吸取無色上清液（含RNA）約400 ?L，移至新的無RNase EP管中，加入600 ?L異丙醇，充分混勻，冰上靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入75%乙醇1 mL，上下顛倒充分洗管壁，棄上清液，室溫下干燥沉淀約5 min。最后向EP管中加入50 ?L RNase-free水溶解，即為提取的總RNA液體，置于-80 ℃冰箱存儲(chǔ)，備用。

2.7.2 總RNA濃度及純度測(cè)定 用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)并確定總RNA的純度與濃度，用A260/A280比值來判斷RNA純度，A（μg/mL）=A260×B×40 μg/mL。（A為總RNA濃度，B為稀釋的倍數(shù)）取2 μL用于RNA濃度及純度鑒定，100 μL Rnase Free dH2O調(diào)零，2 μL總RNA加入98 μLRnase Free dH2O中，分別在260 nm（RNA）和280 nm（PRO）波長處測(cè)OD值，用兩者比值衡量樣本純度，所提取樣本純度應(yīng)當(dāng)在1.8～2.0之間。

2.7.3 總RNA反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系為20 ?L，總RNA量為100 ng，建立反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。試劑確定為5×PrimeScript RT Master Mix、總RNA、Rnase Free dH2O，加入量分別為4、4、12 ?L，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，冷卻至4 ℃。然后混勻并離心，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為cDNA。

2.7.4 RT-PCR檢測(cè)各組目標(biāo)基因表達(dá)水平 取反轉(zhuǎn)錄完成的cDNA，專用SYBR Green熒光染料， RNase-free滅菌水和目的基因引物，引物序列如下：β-actin上游引物5'-AATTACTCCCTCTCCTA-3'，下游引物5'-ACTCATCTACTCCTCTTCT-3'；PI-3K上游引物5'-ACTCCTAAGCCATTAAA-3'，下游引物5'-ATCCAATA CTTTA-3；GLUT4上游引物5'-TTGCAGTGCCTGAGTC TTCTT-3'，下游引物5'-ATCACTTTCTGTGGGGCGTT-3'。應(yīng)用CFX96 RT-PCR擴(kuò)增儀，其反應(yīng)總體系為25 ?L，采用試劑SYBR熒光染料、Forward、Reverse、DNA、無RNA酶滅菌蒸餾水，按順序加入EP管中，用量分別為6.25、0.5、0.5、1、4.25 ?L，最終濃度SYBR熒光染料為1（對(duì)比濃度）、Forward為0.4 ?mol/L×1、Reverse為0.4 ?mol/L×1。低速離心機(jī)離心后，放入RT-PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)完成后，出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的RT-PCR擴(kuò)增曲線與溶解曲線，進(jìn)行PCR半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，給藥前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般情況

空白組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)靈敏，其體表皮毛光滑，且有光澤，食欲正常，尿量未見明顯增減；模型組皮毛有發(fā)黃的趨勢(shì)、較粗糙，毛色失去光澤，喜臥少動(dòng)，飲水量和尿量均增加；進(jìn)入實(shí)驗(yàn)后期，模型組大鼠精神最差，出現(xiàn)不同程度的萎靡，反應(yīng)遲鈍，無力、呈躺臥狀態(tài)，皮毛粗糙明顯，毛色發(fā)黃。與模型組比較，化濁顆粒組、羅格列酮組均有不同程度的改善。

4.2 大鼠體質(zhì)量變化

空白組大鼠體質(zhì)量未見減輕，呈穩(wěn)定持續(xù)上升狀態(tài)。模型組、化濁顆粒組、羅格列酮組實(shí)驗(yàn)早期均有不同程度的體質(zhì)量增加；第5周開始，STZ造模后，各組體質(zhì)量開始下降；給藥10周后，羅格列酮組大鼠體質(zhì)量與模型組比較增加，但化濁顆粒組大鼠體質(zhì)量仍緩慢下降（P<0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量比較（—x±s，g）

組別 只數(shù) 給藥前 給藥后

空白組 12 253.5±25.50 418.9±18.90

模型組 12 247.7±22.83 320.8±18.12

化濁顆粒組 12 250.7±24.53 289.8±15.55#

羅格列酮組 12 248.6±19.85 368.1±17.29

注：與模型組比較，#P<0.05

4.3 化濁顆粒對(duì)大鼠空腹血糖的影響

各組大鼠灌胃治療10周后，模型組FBG較給藥前未見明顯差異，但化濁顆粒組及羅格列酮組FBG較給藥前明顯降低（P<0.05）；化濁顆粒組和羅格列酮組FBG與模型組比較均有降低（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠給藥前后FBG水平比較（—x±s，mmol/L）

組別 只數(shù) 給藥前 給藥后

空白組 12 4.52±0.48 4.48±0.51

模型組 12 21.54±2.88 26.47±1.23

化濁顆粒組 12 22.68±3.42 13.36±1.01#★

羅格列酮組 12 22.45±3.67 12.67±0.87#★

注：與模型組比較，#P<0.05；與本組給藥前比較，★P<0.05（下同）

4.4 化濁顆粒對(duì)大鼠餐后2 h血糖的影響

各組大鼠給藥10周后，模型組OGTT 2 h PG與給藥前比較未見明顯差異，但化濁顆粒組及羅格列酮組OGTT 2 h PG與給藥前比較明顯降低（P<0.05）；給藥后，模型組OGTT 2 h PG高于空白組（P<0.05）；化濁顆粒組及羅格列酮組與模型組比較，OGTT 2 h PG水平均有所降低（P<0.05），羅格列酮組優(yōu)于化濁顆粒組（P<0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠給藥前后OGTT 2 h PG水平比較（—x±s，mmol/L）

組別 只數(shù) 給藥前 給藥后

空白組 12 4.63±0.46 6.94±0.62

模型組 12 21.54±2.88 25.98±3.25

化濁顆粒組 12 22.68±3.42 16.51±1.09★#

羅格列酮組 12 22.45±3.67 12.85±0.67★#*

注：與化濁顆粒組比較，*P<0.05

4.5 化濁顆粒對(duì)大鼠空腹血清胰島素的影響

模型組、化濁顆粒組和羅格列酮組給藥前與空白組比較FINS水平較高；給藥10周后，化濁顆粒組、羅格列酮組與給藥前比較，血清FINS水平有所下降（P<0.05），給藥后與模型組比較也有下降（P<0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠給藥前后血清FINS水平比較（—x±s，mU/L）

組別 只數(shù) 給藥前 給藥后

空白組 12 15.51±1.89 15.82±1.62

模型組 12 25.62±2.81 25.40±2.26

化濁顆粒組 12 25.81±3.24 19.38±3.25★#

羅格列酮組 12 25.90±2.89 19.16±4.75★#

4.6 化濁顆粒對(duì)大鼠磷脂酰肌醇3激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4基因表達(dá)的影響

化濁顆粒組和羅格列酮組骨骼肌組織PI-3K及GLUT4 mRNA表達(dá)與模型組比較有所增加（P<0.05），模型組較空白組PI-3K、GLUT4 mRNA表達(dá)水平呈低表達(dá)（P<0.05）。結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠骨骼肌PI-3K和GLUT4 mRNA表達(dá)比較（—x±s，2-ΔΔCt）

組別 只數(shù) PI-3K mRNA GLUT4 mRNA

空白組 12 1 1

模型組 12 0.96±0.06 0.62±0.07

化濁顆粒組 12 1.10±0.10# 0.77±0.12#

羅格列酮組 12 1.17±0.24# 0.97±0.10#

5 討論

IR是指胰島素執(zhí)行其正常生物作用的效應(yīng)不足，表現(xiàn)為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對(duì)葡萄糖的利用障礙。IR普遍存在于T2DM中，是T2DM的主要發(fā)病因素之一。

PI-3K途徑是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路之一。研究表明，胰島素刺激包括脂肪和骨骼肌在內(nèi)的靶組織攝取利用葡萄糖是通過胰島素受體（InsR）/胰島素受體底物-1（IRS-1）/PI-3K/GLUT4等一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程完成的[9]。在PI-3K途徑中，當(dāng)胰島素與靶細(xì)胞表面InsR結(jié)合，InsR即發(fā)生磷酸化并激活內(nèi)在的酪氨酸激酶，導(dǎo)致IRS-1等酪氨酸殘基磷酸化，并與PI-3K的p85調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合，催化P110而激活PI-3K，活化的PI-3K可加速GLUT4從胞內(nèi)易位至胞膜，調(diào)節(jié)肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取利用。這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的任何環(huán)節(jié)障礙均可引起IR。模型組大鼠FBG、2 h PG、FINS均升高，提示本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物模型基本符合T2DM的特征和要求。藥物干預(yù)后，化濁顆粒能降低大鼠FBG、2 h PG及FINS水平，說明該藥能有效改善T2DM大鼠的糖耐量異常，提高胰島素的敏感性?；瘽犷w粒組與羅格列酮組骨骼肌組織PI-3K及GLUT4 mRNA表達(dá)水平均較模型組顯著增加（P<0.05）。模型組PI-3K及GLUT4 mRNA表達(dá)水平較空白組呈低表達(dá)（P<0.05）。提示化濁顆粒提高胰島素敏感性的作用，與激活骨骼肌組織胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中PI-3K和GLUT4的mRNA表達(dá)有關(guān)。另外，PI-3K和GLUT4活性在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中也起著重要的作用，化濁顆粒是否也通過增加其活性來改善IR，還有待今后進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-10-30）

（修回日期：2014-11-22；編輯：華強(qiáng)）