王蘭萍等

摘要 [目的] 為中華大蟾蜍野生種群資源的保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。[方法] 通過(guò)對(duì)中華大蟾蜍線粒體控制區(qū)的部分序列進(jìn)行測(cè)序分析，研究江蘇沿海地區(qū)中華大蟾蜍不同地域種群的遺傳多樣性。[結(jié)果] 在江蘇省沿海灘涂的3個(gè)地域檢測(cè)到中華大蟾蜍種群的6個(gè)單倍型類(lèi)型，東臺(tái)種群、大豐種群和射陽(yáng)種群的個(gè)體間享有共享的單倍型類(lèi)型，其余單倍型均是各種群獨(dú)享。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，中華大蟾蜍3個(gè)地域種群沒(méi)有形成明顯的地理分布格局。[結(jié)論] 各地域種群間既存在著一定程度的基因交流，也存在一定程度的遺傳分化。

關(guān)鍵詞：中華大蟾蜍；線粒體控制區(qū)；遺傳多樣性；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：S917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）08-093-02

蟾蜍隸屬兩棲綱（Amphibia）、無(wú)尾目（Anura）、蟾蜍科（Bufonidae）、蟾蜍屬（Bufo），在我國(guó)各地均有分布，并且在不同海拔的各種生境中數(shù)量都較多。江蘇沿海地區(qū)中華大蟾蜍（Bufo gargarizans）和花背蟾蜍（Bufo raddei）都是江蘇沿海地區(qū)常見(jiàn)的蟾蜍種類(lèi)[1]，喜棲息于水邊、草叢等陰暗潮濕的地方。它們不僅是農(nóng)作物害蟲(chóng)的天敵，而且是一種動(dòng)物源藥材蟾酥的來(lái)源。筆者通過(guò)對(duì)中華大蟾蜍線粒體控制區(qū)的部分序列進(jìn)行測(cè)序分析，探討江蘇省沿海地區(qū)中華大蟾蜍不同地域種群的遺傳多樣性，以期為中華大蟾蜍野生種群資源的保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 中華大蟾蜍樣本采集自江蘇省鹽城市沿海灘涂地區(qū)，采用隨機(jī)抽樣的方法分別從東臺(tái)市、大豐市和射陽(yáng)縣3個(gè)地域取樣，每個(gè)地域樣本數(shù)量均為10只。所有樣本帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃下冷凍保存。

1.2 基因組DNA提取、mtDNA控制區(qū)PCR擴(kuò)增及測(cè)序 剪取約0.5 g的中華大蟾蜍肌肉樣本，采用組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，TE溶解后-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

用于擴(kuò)增mtDNA控制區(qū)序列的PCR引物參照文獻(xiàn)[2]，上、下游引物序列分別為P1：5′-GCACGATAGCAAGGAACAC-3′和P2：5′-CCGCTTTAAGGTACGATA-3′。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系（50 μl）：5 μl 10×Buffer、4 μl 25 mmol/L MgCl2、4 μl 2.5 mmol/L dNTPs，10 pmol/μl 上游、下游引物各為1 μl，0.3 μl 5 U/μl Taq DNA 聚合酶、1 μl 100 ng/μl DNA模板，余下體積用滅菌超純水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用凝膠回收試劑盒回收純化，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 DNA序列數(shù)據(jù)分析 所有測(cè)序獲得的DNA序列使用DNAstar軟件進(jìn)行編輯、校對(duì)和排序，依據(jù)測(cè)序峰圖手工校正。各個(gè)群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性采用

DnaSP4.0[3]軟件計(jì)算；使用Clustal X1.83[4]軟件進(jìn)行序列的比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育分析使用MEGA5.0軟件[5]，分別采用鄰接法（NJ）和最小進(jìn)化法（ME）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展法1000次重復(fù)抽樣估計(jì)系統(tǒng)樹(shù)中結(jié)點(diǎn)的置信水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA控制區(qū)序列特征 測(cè)序獲得的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中中華大蟾蜍線粒體基因組（NC_008410）比對(duì)分析表明，擴(kuò)增的mtDNA控制區(qū)序列長(zhǎng)度均為366 bp，未發(fā)現(xiàn)插入和缺失序列。測(cè)定的序列中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)變異位點(diǎn)（圖1），包括6個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和1個(gè)單一變異位點(diǎn)；A、T、C、G堿基的平均含量分別為36.6%、31.3%、21.0%和11.1%。

單倍型分析表明，在東臺(tái)種群中檢測(cè)到4種類(lèi)型（DT1、DT2、DT3），大豐種群中檢測(cè)到3種類(lèi)型（DF1、DF2、DF3、DF4），射陽(yáng)種群中檢測(cè)到3種類(lèi)型（SY1、SY2、SY3）；東臺(tái)、大豐和射陽(yáng)種群的單倍型多樣性分別為0.711、0.822和0.600，核苷酸多樣性則分別為 0.007 23、0.007 77和0.006 80（圖1）。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析 采用鄰接法和最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的中華大蟾蜍mtDNA控制區(qū)單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖2所示。從圖2可以看出，2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全相同，只是在單倍型的分支順序上存在差異。基于單倍型序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，中華大蟾蜍的6種單倍型可分為2個(gè)分支，每個(gè)分支中均包含了東臺(tái)、大豐和射陽(yáng)種群中的單倍型類(lèi)型；東臺(tái)種群、大豐種群和射陽(yáng)種群共享了1種單倍型，東臺(tái)種群和大豐種群、東臺(tái)種群和射陽(yáng)種群還分別共享了其他的單倍型。這表明中華大蟾蜍3個(gè)地域種群沒(méi)有形成明顯的地理分布格局。

3 討論

遺傳多樣性不僅是形成生物多樣性的基礎(chǔ)，而且是物種進(jìn)化潛能的保證。遺傳多樣性水平的下降可能導(dǎo)致物種對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的降低，這對(duì)生活在野外多變環(huán)境中的群體而言是一個(gè)極大的威脅[6-7]。因此，在基因水平上檢測(cè)種群的遺傳多樣性有助于了解物種的種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群歷史，進(jìn)而了解其演化過(guò)程，最終有助于制定科學(xué)的保護(hù)策略。

該研究中從中華大蟾蜍種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析表明，2個(gè)參數(shù)都是大豐種群最高，而射陽(yáng)種群最低，表明大豐種群的遺傳多樣性最高而射陽(yáng)種群的遺傳多樣性最低，而出現(xiàn)這種狀況可能與種群所處的環(huán)境相關(guān)。通常認(rèn)為，當(dāng)1個(gè)種群在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)比較穩(wěn)定且資源量豐富時(shí)，該種群可能會(huì)維持較高的遺傳多樣性。近年來(lái)，由于規(guī)?；难睾┩块_(kāi)發(fā)、圍海造田以及化學(xué)污染，在一定程度上大幅度地減少并割裂了江蘇省沿海灘涂中華大蟾蜍的棲息地，過(guò)度的人工捕捉也造成了其野生種群數(shù)量的下降。特別是射陽(yáng)灘涂受到的人為干擾程度最大，從而可能導(dǎo)致該地域內(nèi)中華大蟾蜍種群的遺傳多樣性水平下降。

在江蘇省沿海灘涂的3個(gè)地域檢測(cè)到中華大蟾蜍種群的6個(gè)單倍型類(lèi)型，東臺(tái)種群、大豐種群和射陽(yáng)種群的個(gè)體間享有共享的單倍型類(lèi)型，其余單倍型均是各種群獨(dú)享，獨(dú)享單倍型的存在表明這些地域種群之間已呈現(xiàn)出一定程度的遺傳分化。采用不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)更進(jìn)一步表明，3個(gè)不同種群的中華大蟾蜍分屬于2個(gè)不同的譜系，但這2個(gè)分支與地理分布不相關(guān)，表明中華大蟾蜍正處于譜系重排（Lineage sorting）階段而并沒(méi)有按采樣點(diǎn)的地理單元分開(kāi)。這說(shuō)明各地域種群間既存在著一定程度的基因交流，也存在一定程度的遺傳分化。

參考文獻(xiàn)

[1] 蔣志剛，丁玉華. 大豐麋鹿與生物多樣性[J].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2011.

[2] HU Y L，WU X B，JIANG Z G，et al. Population Genetics and Phylogeography of Bufo gargarizans in China[J]. Biochem Genet， 2007， 45： 697-711.

[3] ROZAS J，SNCHEZ-DELBARRIO J C，MESSEGUER X，et al.DNAsp， DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J].Bioinfor， 2006， 19：2496-2497.

[4] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The CLUSTAL-X windows interface： Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Res， 1997， 25（24）： 4876-4882.

[5] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5： Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood， Evolutionary Distance， and Maximum Parsimony Methods[J]. Molecular Biology and Evolution， 2011， 28：2731-2739.

[6] VRIJEHOEK R C.Genetic diversity and fitness in small populations. In： Conservation Genetics [M]. Basel： Birkhüuser， 1994.

[7] FRANKHAM R，BALLOU J D，BRISCOE D A.Introduction to Conservation Genetics [M]. Cambridge： Cambridge University Press， 2002.