陳裕坤 林玉玲 賴鐘雄

摘 要 ELF4家族是植物特有基因，能調(diào)節(jié)生物鐘、調(diào)控開花時間、感受光周期和參與幼苗去黃化等。以龍眼松散型胚性愈傷組織為材料，采用RT-PCR結(jié)合RACE法克隆了ELF4家族3個成員cDNA全長，分別命名為DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4。DlELF4全長599 bp，編碼140個氨基酸；DlELF4-LIKE 1全長762 bp，編碼142個氨基酸；DlELF4-LIKE 4全長661 bp，編碼114個氨基酸；DlELF4家族成員均為不穩(wěn)定的親水蛋白，無信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)，都含有DUF1313保守功能結(jié)構(gòu)域。進化樹分析表明，植物中ELF4家族可分成二個亞組，ELF4與ELF4-LIKE 1聚為一組，ELF4-LIKE 2、3、4聚為另一組。qPCR結(jié)果表明：在體胚發(fā)生過程中DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4表達模式相同，均在球形胚時期表達量極高，而在其它時期表達量很低；DlELF4家族對不同光質(zhì)和不同處理時間的響應存在差異：DlELF4的表達經(jīng)24 h處理時可能受綠光和紅光誘導，經(jīng)72 h處理時可能受紅光、藍光和白光誘導；DlELF4-LIKE 1的表達在24 h處理時可能受綠光誘導，經(jīng)72 h處理時受紅光和綠光抑制；DlELF4-LIKE 4的表達在24 h和72 h處理時可能受藍光和白光誘導。水楊酸和茉莉酸甲酯能促進龍眼胚性愈傷組織中DlELF4家族成員的表達。以上結(jié)果表明，ELF4家族可能參與龍眼體胚發(fā)生過程中球形胚的形態(tài)建成與脅迫應答。

關鍵詞 龍眼；體胚發(fā)生；ELF4家族；克?。槐磉_分析

中圖分類號 S602.3 文獻標識碼 A

Cloning and Characterization of ELF4 Family Genes from

Embryogenic Callus in Dimocarpus longan Lour.

CHEN Yukun， LIN Yuling， LAI Zhongxiong*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ELF4 family has not been detected outside the plant kingdom， and it is involved in the promotion of circadian clock， flowering time， photoperiod perception and seedling de-etiolating. The RT-PCR combined with RACE method was used to obtain the complete 3 cDNA sequences of ELF4 family's from the embryogenic callus in Dimocarpus longan. The complete cDNA sequence of DlELF4 was 599 bp， encoding 140 amino acids， and that of DlELF4-LIKE 1 and DlELF4-LIKE 4 was 762 bp， encoding 142 amino acids， and 661 bp， encoding 114 amino acids， respectively. DlELF4， DlELF4-LIKE 1 and DlELF4-LIKE 4 were unstable and hydrophilic proteins， without signal peptides and transmembrane structures， but had the DUF1313 protein function domain. Anglicizing phylogenetic tree of ELF4 family in plants indicated that ELF4 family can be divided into two subgroups. ELF4 and ELF4-LIKE 1 was gathered as one group， while ELF4-LIKE 2， 3 and 4 were clustered into another group. qPCR results indicated that DlELF4 family showed the same expression pattern during the somatic embryogenesis， they expressed at the highest levels in the globular embryos， but very low levels in other embryogenic stages. DlELF4 family showed different responses with different light quality and treatment time. DlELF4 may be induced by the green and red light after 24 h treatment and may be induced by the red， blue and white light after 72 h； DlELF4-LIKE 1 may be induced by the green light after 24 h treatment， but may be suppressed by the red and green light after 72 h； DlELF4-LIKE 4 may be induced by the blue and white light after 24 and 72 h treatment. DlELF4 family makes the positive response with SA and MJ treatment. The above results showed that ELF4 family might participate in globular embryoid's morphogenesis during somatic embryogenesis and stress responses.

Key words Longan； Somatic embryogenesis； ELF4 family； Cloning； Expression analyzing

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.008

EARLY FLOWERING 4（ELF4）最早由Doyle于2002年發(fā)現(xiàn)并命名的[1]，該基因主要參與植物的光周期感知、生物鐘調(diào)節(jié)，不僅能提升植物生物鐘的精度，在缺少晝夜周期時對生物節(jié)律的維持又是必不可少的[1-4]；elf4突變體中中央振蕩器元件CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）的表達量減弱[1]。ELF4家族是一個植物特有的基因家族，在擬南芥中還包括4個同源基因ELF4-LIKE 1（EFL1）、ELF4-LIKE 2（EFL2）、ELF4-LIKE 3（EFL3）、ELF4-LIKE 4（EFL4），他們都具有DUF1313功能結(jié)構(gòu)域，但其功能仍然未知[1，5-6]。ELF4的表達被光敏色素B調(diào)控，參與幼苗的去黃化、生物鐘調(diào)節(jié)和光周期感受等過程[1，5]。在光照下，ELF4促進CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）的表達，而CCA1和LHY抑制ELF4的表達[3，7]；ELF4、EARLY FLOWERING 3（ELF3）及LUX ARRHYTHMO（LUX）組成的蛋白復合體調(diào)控PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4（PIF4）和PIF5的表達，進而調(diào)控植物的生長[8]。ELF4還能調(diào)控擬南芥的開花時間，在非誘導的光周期條件下elf4突變體的早花現(xiàn)象可能是由于CONSTANS（CO）的大量表達所引起的。在擬南芥中ELF4蛋白通過控制GI（gigantea）的亞細胞定位來調(diào)控開花[9]，而GI能夠結(jié)合到CO基因的啟動子上來調(diào)控CO的表達[10]。Adeyemo等[11]的研究表明過量表達木薯MeELF4可以使擬南芥elf4突變體的開花時間和下胚軸恢復正常。

目前，龍眼中ELF4家族的功能未知，ELF4家族與體胚發(fā)育過程的相互關系更是未見報到。近年來，本實驗室借助多種分子生物學手段，已對龍眼體胚發(fā)生過程開展多項研究，如采用Solexa測序技術(shù)對龍眼體胚發(fā)生過程中的miRNAs進行鑒定[12]，得到部分與已知的miRNAs相似的序列；建立了龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫等[13]。本研究在這些工作的基礎上，分離和克隆了龍眼胚性愈傷組中ELF4、ELF4 LIKE 1和ELF4 LIKE 4的cDNA全長序列，借助生物信息學分析方法初步推測龍眼胚性愈傷組織ELF4家族的功能，預測調(diào)控ELF4的潛在miRNAs，研究其在體胚發(fā)育的不同階段、不同光質(zhì)處理和不同濃度水楊酸及茉莉酸甲酯處理下的表達模式，為探討DlELF4家族的功能等后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料及RNA提取與cDNA合成

龍眼松散型胚性愈傷組織（‘紅核子品種LC2細胞系）由福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所提供[14-16]。按龍眼體胚發(fā)生同步化調(diào)控的方法，獲得松散型胚性愈傷組織、不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)、球形胚、魚雷形胚和子葉形胚5個不同發(fā)育階段的胚性培養(yǎng)物[17-18]。以培養(yǎng)18 d的龍眼胚性愈傷組織為材料，分別接種在含有（0、50、75、100 μmol/L）水楊酸（SA）和（0、50、75、100、150 μmol/L）茉莉酸甲酯（MJ）的液體培養(yǎng)基中黑暗振蕩（120 r/min，25 ℃）培養(yǎng)24 h，分別在不同光質(zhì)（黑暗、紅光、綠光、藍光和白光）下培養(yǎng)24 h和72 h。取以上材料作為實時熒光定量PCR的試驗材料。龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組SRR accession numbers：SRA050205。參照賴呈純等[19]和李惠華等[20]的方法，提取龍眼胚性愈傷組織總RNA，用于合成RT-PCR的cDNA。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及PCR擴增 3′-RACE和5′-RACE：采用RACE法，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析所得的序列分別設計2條3′-RACE引物，結(jié)合GeneRacerTM 3′Primer和GeneRacerTM 3′Nested Primer引物，以龍眼松散型胚性愈傷組織cDNA為模板，進行巢式PCR反應擴增3′未端序列；根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析所獲得序列分別設計2條5′-RACE引物，并結(jié)合GeneRacerTM 5′Primer和GeneRacerTM 5′Neste Primer引物，以龍眼松散型胚性愈傷組織cDNA為模板，進行巢式PCR反應擴增5′未端序列。

拼接驗證：對轉(zhuǎn)錄組分析所得序列、3′未端序列和5′未端序列的測序結(jié)果進行全長拼接，設計拼接驗證引物，PCR反應驗證拼接結(jié)果。以上引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。所有引物的名稱、引物序列及擴增用途見表1。

PCR反應體系和擴增程序參照賴呈純等[19]和李惠華等[20]的方法，根據(jù)擴增不同的目的片段，對PCR擴增程序進行相應的調(diào)整。獲得目的片段后切膠回收，TA克隆后挑取陽性克隆子的菌液進行PCR擴增，將陽性菌液送華大基因公司測序。

1.2.2 生物信息學分析 ExPASy Protparam預測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；SignalP 4.0 Server預測蛋白質(zhì)信號肽；以PSORT Prediction（plant）進行亞細胞定位預測；EMBnet TMpred預測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；NetPhos2.0預測蛋白質(zhì)磷酸化位點；PredictProtein在線預測其它功能位點；經(jīng)InterPro預測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，以PSIPRED預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；Mega6.06 Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ法）構(gòu)建核苷酸序列的分子系統(tǒng)進化樹（P-distance法），并用bootstrap法（重復1 000次）評估系統(tǒng)進化樹。為了解miRNA與DlELF4家族的相互調(diào)控關系，本研究以Lai等[12]新鑒定的龍眼中保守或特異的miRNA序列為探針，以DlELF4家族3個成員的核酸序列為靶基因預測的候選序列，采用psRNA Target在線軟件，預測潛在調(diào)控DlELF4家族成員表達的miRNA。

1.2.3 龍眼體胚發(fā)生不同階段DlELF4家族成員的表達分析 參照Lin等[21]建立的多基因內(nèi)參體系，以檢測龍眼胚性愈傷組織中DlELF4家族成員在體胚發(fā)生不同階段的表達情況。本試驗采用LightCycler480儀器和Takara SYBR ExScriptTM試劑，以龍眼體胚（松散型胚性愈傷組織、不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)、球形胚、魚雷形胚和子葉形胚）5個階段的cDNA稀釋后作為模板，根據(jù)熒光定量PCR引物設計基本原則設計DlELF4家族成員的上下游引物進行qPCR擴增。將試驗中5個時期的cDNA模板的混合樣進行5倍梯度系列稀釋制作標準曲線。根據(jù)軟件自動分析的DlELF4家族成員標準曲線的斜率可得PCR擴增效率（E），E=10（-1/slope）。qPCR反應體系和擴增程序參照Lin和Lai的方法[21]。待反應結(jié)束后進行擴增曲線、溶解曲線（60～95 ℃）和凝膠電泳分析，檢測引物特異性；每個反應包括3個重復，根據(jù)擴增曲線計算Ct值，并獲得不同階段DlELF4家族成員的mRNA相對含量，通過內(nèi)參基因的校正最終得到目的基因的相對表達量。

1.2.4 不同光質(zhì)和不同濃度水楊酸、茉莉酸甲酯處理后DlELF4家族成員的表達分析 參照Lin等[21]建立的多基因內(nèi)參體系，以檢測龍眼胚性愈傷組織在不同光質(zhì)（黑暗、紅光、綠光、藍光和白光）處理24 h和72 h后DlELF4家族成員的表達情況，以及在不同濃度（0、50、75、100 μmol/L）水楊酸和（0、50、75、100、150 μmol/L）茉莉酸甲酯處理24 h后的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼胚性愈傷組織DlELF4家族成員cDNA全長序列獲得及其序列分析

將龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[13]中3條注釋與ELF4相關的核苷酸序列（Unigene54774、Unigene5551、Unigene51684）及其推導的氨基酸序列分別在NCBI上經(jīng)Blastn和Blastp分析，均與數(shù)據(jù)庫中已有的ELF4基因家族的核苷酸和氨基酸序列具有較高的同源性，初步推斷這些片段為龍眼胚性愈傷組織中DlELF4基因家族的部分cDNA序列。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的已知序列，分別設計3′-RACE和5′-RACE引物，采用RACE法擴增DlELF4家族成員的3′末端序列和5′末端序列，經(jīng)二輪PCR后均可擴增出與預期相符的片段。測序結(jié)果表明：DlELF4的5′-RACE片段大小為314 bp，3′-RACE片段大小為168 bp；DlELF4-LIKE 1的5′-RACE片段大小為263 bp，3′-RACE片段大小為421 bp；DlELF4-LIKE 4的5′-RACE片段大小為224 bp，3′-RACE片段大小為353 bp。經(jīng)DNAMAN6.0拼接，DlELF4、DlELF4-LIKE 1、DlELF4-LIKE 4的cDNA全長分別為：599、762、661 bp；采用RT-PCR法對拼接結(jié)果進行驗證，測序結(jié)果表明DlELF4、DlELF4-LIKE 1、DlELF4-LIKE 4的序列長分別為：423、429、345 bp，與拼接結(jié)果相符合。DlELF4、DlELF4-LIKE 1、DlELF4-LIKE 4的GenBank登錄號分別為KJ480950、KP015057、KP015057。

DlELF4 cDNA全長599 bp，開放閱讀框（ORF）423 bp，編碼140個氨基酸，5′-UTR為33 bp，3′-UTR為143 bp，PolyA尾巴為42 bp；DlELF4 LIKE 1 cDNA全長762 bp，ORF 429 bp，編碼142個氨基酸，5′-UTR為52 bp，3′-UTR為281 bp，PolyA尾巴為24 bp；DlELF4 LIKE 4 cDNA全長661 bp，ORF 345 bp，編碼114個氨基酸，5′-UTR為49 bp，3′-UTR為267 bp，PolyA尾巴為22 bp。

2.2 龍眼胚性愈傷組織DlELF4家族的生物信息學分析

利用ExPASy Protparam預測其DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE4的理化性質(zhì)，見表2。SignalP4.0 Server和EMBnet TMpred軟件預測可知DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE4都沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。經(jīng)PredictProtein亞細胞定位預測可知DlELF4定位于葉綠體基質(zhì)、DlELF4-LIKE 1定位于細胞核，DlELF4-LIKE 4定位于細胞質(zhì)中。根據(jù)NetPhos 2.0預測，DlELF4含有15個蛋白磷酸化位點（Ser：14，Thr：1，Tyr：0），DlELF4-LIKE 1含有11個蛋白磷酸化位點（Ser：5，Thr：6，Tyr：0），DlELF4-LIKE 4含有5個蛋白磷酸化位點（Ser：4，Thr：0，Tyr：1）；經(jīng)PredictProtein預測其它功能位點可知，DlELF4含有2個N-糖基化位點、1個cAMP與cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點、2個蛋白激酶C磷酸化位點、5個酪蛋白激酶II磷酸化位點；DlELF4-LIKE 1含有2個N-糖基化位點、2個cAMP 與cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點、3個蛋白激酶C磷酸化位點、3個酪蛋白激酶II磷酸化位點；DlELF4-LIKE 4含有3個N-糖基化位點、2個酪蛋白激酶II磷酸化位點、2個N-酰基化位點。Introprotein預測表明DlELF4家族成員都含有功能未知的DUF1313保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。采用PSIPRED在線軟件預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成（圖2），DlELF4中α-螺旋47.9%、無規(guī)則卷曲52.1%、無β-折疊；DlELF4-LIKE 1中α-螺旋43.7%、無規(guī)則卷曲56.3%、無β-折疊；DlELF4-LIKE 4中α-螺旋56.1%、無規(guī)則卷曲42.1%、β-折疊1.8%。

2.3 ELF4家族的進化樹分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中擬南芥（Arabidopsis thaliana）、可可（Theobroma cacao）、大豆（Glycine max）、甜橙（Citrus sinensis）和葡萄（Vitis vinifera）的相關氨基酸序列，采用Mega6.06軟件的鄰近相鄰法（NJ法）構(gòu)建ELF4的系統(tǒng)進化樹（圖3），結(jié)果表明ELF4家族可分成二個亞組：ELF4和ELF4-LIKE 1聚為一組，ELF4-LIKE2、3和4聚為另一組；其中，龍眼DlELF4與擬南芥AtELF4的親緣關系最近，DlELF4-LIKE 1與大豆和甜橙的ELF4-LIKE 1親緣關系較近；DlELF4-LIKE 4與可可、葡萄的ELF4-LIKE 4親緣關系最近。

2.4 潛在調(diào)控DlELF4家族的miRNA預測

psRNA Target預測結(jié)果（表3）表明，DlELF4家族成員受到miRNA的調(diào)控。DlELF4同時受到5種miRNA的調(diào)控；DlELF4-LIKE 1可能同時受到4種miRNA的調(diào)控，DlELF4-LIKE 4可能同時受到7種miRNA的調(diào)控。有些miRNA以抑制靶標基因的翻譯方式調(diào)控DlELF4家族成員的表達，有些則以裂解mRNA的方式抑制靶標基因的表達。一個miRNA可同時調(diào)控多個靶標，如miR1535可同時調(diào)控DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4。

2.5 龍眼體胚不同發(fā)育階段DlELF4家族的表達分析

qPCR結(jié)果表明，DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4在龍眼體胚發(fā)生過程中的表達模式相同：在松散型胚性愈傷組織和不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)階段的表達量較低，在球形胚階段的表達量急劇升高并且達到峰值，而在隨后的魚雷形胚和子葉形胚階段的表達量又急劇下降（圖4）。從以上結(jié)果可以看出，在龍眼體胚發(fā)育過程中，DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出一定的組織特異性和時空差異，對龍眼體胚的生長和發(fā)育可能具有調(diào)控功能。

2.6 不同光質(zhì)處理和不同濃度水楊酸、茉莉酸甲酯處理后DlELF4家族成員的表達分析

qPCR結(jié)果表明，不同光質(zhì)處理24 h后DlELF4的表達量依次為：綠光>紅光>白光>藍光>黑暗，但經(jīng)過72 h處理后DlELF4的表達量依次為：白光>藍光>紅光>綠光>黑暗，DlELF4的表達在24 h處理時可能受到綠光、紅光、白光和藍光的誘導，其中綠光的誘導最明顯，經(jīng)過72 h處理后可能受到紅光、藍光和白光的誘導；不同光質(zhì)處理24 h后DlELF4-LIKE 1的表達量依次為：綠光>黑暗>紅光>白光>藍光，但經(jīng)過72 h處理后白光、藍光同黑暗處理的表達量相當，綠光下表達量最低；不同光質(zhì)處理24 h后DlELF4-LIKE 4在紅光和綠光處理下的表達量與黑暗處理下表達量相當，在藍光和白光處理下的表達量比黑暗處理略有增加，經(jīng)過72 h處理后DlELF4-LIKE 4在藍光和黑暗下的表達相當且比24 h藍光處理時略有升高，紅光處理下表達量低于藍光處理，綠光處理的表達量最低，白光處理的表達量達到最高，DlELF4-LIKE 4可能受到藍光或白光的誘導。說明DlELF4家族成員對不同光質(zhì)的響應存在差異。

50、75和100 μmol/L的水楊酸處理24 h后，DlELF4家族成員表達量均呈現(xiàn)急劇上升；DlELF4 LIKE 1表達量略有升高，在75 μmol/L時表達量達到峰值；DlELF4 LIKE 4的表達量隨著濃度的升高逐漸升高，在100 μmol/L時表達量最大。說明水楊酸能促進龍眼胚性愈傷組織中DlELF4家族成員的表達。不同濃度茉莉酸甲酯處理24 h后，DlELF4家族成員的表達量均明顯增加，呈現(xiàn)出先升高后降低又再升高的類“N”狀趨勢，在50 μmol/L和75 μmol/L時表達量逐漸升高，并在75 μmol/L時表達量達到峰值，隨后在100 μmol/L時表達量下降，在150 μmol/L時表達量又略有升高（圖5）。說明茉莉酸甲酯能促進龍眼胚性愈傷組織中DlELF4家族成員的表達，在75 μmol/L的濃度下促進作用最明顯。

3 討論與結(jié)論

3.1 DlELF4家族成員功能的生物信息學初步推測

植物的生物鐘是由許多相互聯(lián)系的反饋循環(huán)網(wǎng)絡共同構(gòu)成的，缺失任何一個組分都會改變中央振蕩器的速度。生物鐘中樞基因ELF4可正向調(diào)節(jié)CCA1和LHY的表達，與CCA1/LHY-TOC1循環(huán)網(wǎng)絡相互聯(lián)鎖，是中央振蕩器的核心組分，elf4突變體表現(xiàn)出無節(jié)奏的現(xiàn)象[2-3，7]。Herrero等[22]研究發(fā)現(xiàn)，ELF4/ELF3和LUX ARRHYTHMO（LUX）復合物是維持植物生物晝夜節(jié)律鐘的關鍵。Kima等[23]研究表明ELF4與GI在植物晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等過程中具有協(xié)同或累加效應，ELF4與GI通過差異的相位特異遺傳影響擬南芥的開花時間、下胚軸伸長和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等功能。在擬南芥中已證實ELF4基因有著多種功能，例如，ELF4調(diào)控著生物節(jié)奏、控制著擬南芥的成花[1]，參與了幼苗的去黃化、生物鐘功能、和光周期的感受[2，4-5，7，]，控制著擬南芥下胚軸的生長[8]。通過生物信息學分析可知，龍眼ELF4家族的3個成員都是不穩(wěn)定的親水蛋白，都沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，但都具有DUF1313功能結(jié)構(gòu)域，且N端和C端氨基酸序列變化較大。DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4亞細胞預測分別定位于葉綠體基質(zhì)、細胞核和細胞質(zhì)中。根據(jù)進化樹分析可知DlELF4和DlELF4-LIKE 1聚為同一亞組，而DlELF4-LIKE 4為另一亞組成員。龍眼ELF4生物信息學分析結(jié)果與前人的研究相符合[1-6]，初步推測DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4為龍眼ELF4家族成員，可能具有生物鐘調(diào)節(jié)、開花時間調(diào)控、光周期感受及參與幼苗去黃化等功能。

3.2 ELF4可能參與龍眼體胚發(fā)生過程中球形胚的形態(tài)建成與脅迫應答

頂端細胞通過幾次分裂后形成輻射對稱的球形胚胎。此過程中未發(fā)生器官分化，唯一分化形成的組織是原表皮層（protodom），它以后在幼苗中形成表皮[24]。球形胚時期原表皮層的分化標志著體細胞胚結(jié)構(gòu)分化的開始。初始前形成層的形成是體細胞胚形態(tài)轉(zhuǎn)變的第一個信號[25]。qPCR結(jié)果顯示，DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4在龍眼體胚發(fā)生過程中的表達模式極其相似，即在其它發(fā)育階段的表達量都很低，只有在球形胚階段的表達量極高，說明ELF4家族3個成員在龍眼體胚發(fā)生過程中可能具有相似的作用，即促進體胚早期階段的發(fā)育，可能與球形胚時期原表皮層的形成有關，表明ELF4家族可能參與龍眼體胚發(fā)生過程中球形胚的形態(tài)建成。

不同光質(zhì)處理后24 h和72 h后，DlELF4、DlELF4 LIKE 1和DlELF4 LIKE 4具有不同的表達模式：DlELF4的表達在24 h處理時可能受到綠光和紅光的誘導，經(jīng)過72 h處理后可能受到紅光、藍光和白光的誘導；DlELF4-LIKE 1的表達在24 h處理時可能受到綠光誘導，經(jīng)過72 h處理時卻受到紅光和綠光的抑制；DlELF4-LIKE 4的表達在24 h和72 h處理時可能受到藍光和白光的誘導。說明DlELF4家族成員對不同光質(zhì)的響應存在差異。不同濃度的水楊酸處理24 h后，DlELF4家族成員表達量均呈現(xiàn)劇烈升高，說明水楊酸能促進龍眼胚性愈傷組織中DlELF4家族成員的表達。不同濃度茉莉酸甲酯處理24 h后，DlELF4家族成員的表達量也出現(xiàn)明顯上升趨勢，說明茉莉酸甲酯能促進龍眼胚性愈傷組織中DlELF4家族成員的表達。ELF4家族可能參與龍眼體胚發(fā)生過程的脅迫應答。當然，植物體內(nèi)的每一個生理生化現(xiàn)象的機理是十分復雜的，要探索ELF4家族的功能還需要驗證其在龍眼活體胚不同發(fā)育階段或龍眼花不同發(fā)育時期的表達分析、亞細胞定位、基因功能驗證、miRNA的鑒定等后續(xù)研究。

參考文獻

[1] Doyle M R， Davis S J， Bastow R M， et al. The ELF4 gene controls circadian rhythms and flowering time in Arabidopsis thaliana[J]. Nature， 2002， 419： 74-77.

[2] McWatters H G， Kolmos E， Hall A， et al. ELF4 is required for oscillatory properties of the circadian clock[J]. Plant Physiol， 2007， 144： 391-401.

[3] Kolmos E， Davis S J. ELF4 as a central gene in the circadian clock[J]. Plant Signal Behav， 2007， 2： 370-372.

[4] Kolmos E， Nowak M， Werner M， et al. Integrating ELF4 into the circadian system through combined structural and functional studies[J]. Front Life Sci（formerly HFSP J）， 2009， 3： 350-366.

[5] Khanna R， Kikis E A， Quail P H. EARLY FLOWERING 4 functions in phytochrome B-regulated seedling de-etiolation[J]. Plant Physiol， 2003， 133（4）： 1 530-1 538.

[6] Boxall S F， Foster J M， Bohnert H J， et al. Conservation and divergence of circadian clock operation in a stress-inducible Crassulacean acid metabolism species reveals clock compensation against stress[J]. Plant Physiol， 2005， 137： 969-982.

[7] Kikis E A， Khanna R， Quail P H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY[J]. The Plant Journal， 2005， 44（2）： 300-313.

[8] Nusinow D A， Helfer A， Hamilton E E， et al. The ELF4-ELF3-LUX complex links the circadian clock to diurnal control of hypocotyl growth[J]. Nature， 2011， 475： 398-402.

[9] Kim Y， Lim J， Yeom M， et al. ELF4 Regulates GIGANTEA Chromatin Access through Subnuclear Sequestration[J]. Cell Rep， 2013， 3（3）： 671-677.

[10] Sawa M， Kay S A. GIGANTEA directly activates Flowering Locus T in Arabidopsis thaliana[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2011， 108（28）： 11 698-11 703.

[11] O S Adeyemo， Elsebeth Kolmos， Joe Tohme， et al. Identification and Characterization of the Cassava Core-Clock Gene EARLY FLOWERING 4[J]. Tropical Plant Biol， 2011， 4： 117-125

[12] Lai Z， Lin Y. Analysis of the global transcriptome of longan （Dimocarpus longan Lour.）embryogenic callus using Illumina paired-end sequencing[J]. BMC Genomics， 2013， 14： 561. doi： 10.1186/1471-2164-14-561.

[13] Lin Y， Lai Z. Comparative Analysis Reveals dynamic changes in miRNAs and their targets and expression during somatic embryogenesis in longan（Dimocarpus longan Lour.）[J]. PLoS ONE， 2013， 8（4）： e60337. doi： 10.1371/journal. pone.0060337.

[14] Lai Z X， Chen C L， Zeng L H， et al. Somatic embryogenesis in longan（Dimocarpus longan Lour.）[J]. Forestry Sciences， 2000， 67： 415-432.

[15] 賴鐘雄， 潘良鎮(zhèn)， 陳振光. 龍眼胚性細胞系的建立與保持[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報， 1997， 26（2）： 160-167.

[16] 賴鐘雄， 陳振光. 龍眼胚性愈傷組織的高頻率體細胞胚胎發(fā)生[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報， 1997， 26（3）： 271-276.

[17] 陳春玲， 賴鐘雄. 龍眼胚性愈傷組織體胚發(fā)生同步化調(diào)控及組織細胞學觀察[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2002， 31（2）： 192-194.

[18] 方智振， 賴鐘雄. 龍眼體胚發(fā)生中期發(fā)育同步化的初步調(diào)控[J]. 中國農(nóng)學通報， 2009， 25（1）： 152-155.

[19] 賴呈純， 賴鐘雄， 方智振， 等. 龍眼胚性愈傷組織線粒體ATP 合酶β亞基基因克隆及其在龍眼體胚發(fā)生過程中的表達分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2010， 43 （16）： 3 392-3 401.

[20] 李惠華， 賴鐘雄， 林玉玲， 等. 龍眼胚性愈傷組織ACC氧化酶基因的克隆及其在龍眼體胚發(fā)生過程中的表達分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2010， 43 （18）： 3 798-3 808.

[21] Lin Y L， Lai Z X. Reference genes selection for qPCR analysis during somatic embryogenesis in longan tree[J]. Plant Science， 2010， 178 （4）： 359-365.

[22] Herrero E， Kolmos E， Bujdoso N， et al. EARLY FLOWERING4 Recruitment of EARLY FLOWERING3 in the Nucleus Sustains the Arabidopsis Circadian Clock[J]. The Plant Cell， 2012， 24： 428-443.

[23] Kima Y， Yeoma M， Kim H， et al. GIGANTEA and EARLY FLOWERING 4 in Arabidopsis Exhibit differential phase-specific genetic influences over a diurnal cycle[J]. Molecular Plant， 2012， 5： 678-687.

[24] Anke J de Jong， Ed D L Schmidt， Sacco C de Vries. Early events in higher-plant embryogenesis[J]. Plant Molecular Biology， 1993， 22： 367-377.

[25] 曹景林. 棉花體胚同步發(fā)生及相關基因表達和蛋白磷酸化分析[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學， 2008.