鐘植文，冼望強，黎先偉，何柳芬，劉 薇，楊傲冰*

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州511356;2.廣東省動物防疫物資儲備中心，廣州510520)

禽流感是由A型流感病毒引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合征，分高致病性和低致病性兩種，低致病性以H9亞型禽流感為主［1］。目前國內(nèi)養(yǎng)雞場多常用BJ94類，如F、SS、SD696等毒株的疫苗，起到一定的預防作用，但未能達到100%的完全保護，仍有 H9亞型禽流感發(fā)生［2－3］。2013年冬，廣東珠三角地區(qū)某雞場的肉雞群發(fā)病并出現(xiàn)死亡，發(fā)病前4天死亡率共計超過1%。本試驗從發(fā)病肉雞群中采樣，經(jīng)病毒的分離、鑒定，確定為H9亞型禽流感病毒。對分離株的HA基因進行序列測定和分析，并與近年流行的H9亞型禽流感毒株和部分常用疫苗毒株HA基因、蛋白進行相似性比較和分析，旨在從分子水平上了解廣東地區(qū)目前H9亞型禽流感病毒的毒力特點，為該病的預防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣本 于2013年采自廣東珠三角地區(qū)某雞場的發(fā)病肉雞群。

1.1.2 試驗動物 10日齡SPF雞胚由廣東永順生物制藥股份有限公司提供。

1.1.3 試劑 新城疫病毒、減蛋綜合癥病毒、禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)、H5、H7、H9標準陽性血清購自廣東省動物防疫監(jiān)督所;MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、M － MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP、Premix Ex Taq購自 TaKaRa(大連)公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離和傳代 采集發(fā)病雞的氣管、肺臟等臟器，研磨后凍融3次，3000 r/min離心8 min，上清液經(jīng)細菌濾器過濾除菌。濾液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚8只，0.2 mL/只，接種后置37℃溫箱孵化，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，每天照胚三次，將死亡雞胚置于4℃冰箱，至第96 h將全部雞胚置于4℃冰箱。觀察死亡雞胚病變，收獲死亡雞胚和凍死雞胚尿囊液，并作無菌檢查，然后連續(xù)傳代。

1.2.2 血凝試驗和血凝抑制試驗 參照文獻［4－5］配制1%雞紅細胞懸液，取分離株雞胚尿囊液進行微量血凝試驗;然后具有血凝活性的雞胚尿囊液分別與新城疫病毒、減蛋綜合癥病毒和禽流感病毒H5亞型、H7亞型、H9亞型的標準陽性血清進行微量血凝抑制試驗。

1.3 基因型鑒定

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)該毒株的初步實驗結(jié)果，從GenBank上獲取多株H9亞型AIV基因序列分析比較后，使用 DNAStar(Verison4.0)和 Primer Premier(Verison5.0)針對HA基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計了1對特異性引物，用于擴增包含HA基因的核苷酸片段，所設(shè)計引物送上海英駿生物有限公司按照PAGE級別合成。引物序列如下，HA1:AGCAAAAGCAGGGG;HA2:AGTAGAAACAAGGGTGTT，預計擴增1700 bp。

1.3.2 RT－PCR 反應 用 Takara MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取分離株雞胚尿囊液的病毒總RNA，用隨機引物為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，再用針對H9亞型禽流感病毒HA基因所設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增檢測，將RT－PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。

1.3.3 序列測定和分析 擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行序列測定，將測得的序列提交NCBI BLAST SERVER進行聯(lián)機檢索。應用DNAStar軟件分析HA蛋白裂解位點的氨基酸序列、受體結(jié)合位點以及潛在的糖基化位點，并利用 MEGA 5軟件繪制系統(tǒng)進化樹。從GenBank上獲得 BJ94、SS、F、SD696 等疫苗毒株以及近年來流行毒株的HA基因核苷酸序列(表1)，結(jié)合本試驗分離株的相應序列，利用DNAStar軟件包中的MegAlign程序中Clustal W方法進行相似性比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離和傳代 經(jīng)處理的病料接種10日齡SPF雞胚，96 h內(nèi)均未出現(xiàn)死亡，收獲凍死雞胚尿囊液，無菌檢查為陰性。

2.2 血凝試驗和血凝抑制試驗 分離株的雞胚尿囊液能凝集雞紅細胞，表明其對雞紅細胞具有血凝性，血凝效價(HA)為1∶256。而新城疫病毒、減蛋綜合癥病毒和禽流感病毒H5亞型、H7亞型、H9亞型的標準陽性血清對分離株的血凝抑制效價(HI)分別為 ＜1∶2、＜1∶2、＜1∶2、＜1∶2、1∶256，證明分離到的病毒株為禽流感病毒H9亞型，命名為A/chicken/Guangdong/JL/2014(簡稱為JL)。

2.3 RT－PCR擴增結(jié)果 利用特異性引物對JL株的RNA進行RT－PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得與預期大小一致的目的片段(圖1)。

2.4 HA基因序列的測定及遺傳進化分析 序列測定后，將JL株的HA基因序列經(jīng)NCBI BLAST SERVER檢索，結(jié)果顯示其與GenBank上的RZ853株的核苷酸序列相似性最高，達到97%。利用DNAStar軟件對JL株的HA基因序列進行分析，結(jié)果表明其HA基因含有一個長度為1683個核苷酸的完整ORF，預計編碼560個氨基酸。推導的氨基酸序列分析表明，當中含有8個潛在的糖基化位點，依 次 為:29NST、141NVS、145NGT、298NTT、305NVS、313NCS、492NGT、551NGS。受體結(jié)合位點的氨基酸分別為:109Y、161W、163T、191N、198T、202L、203L，即除了198位氨基酸有所變化外，其它位點均很保守;而其226位氨基酸為L，為哺乳動物受體結(jié)合位點的特征氨基酸。裂解位點(335～341位)的氨基酸序列為RSSR↓GLF，裂解位點附近均無連續(xù)堿性氨基酸插入，僅能被有限的細胞蛋白酶識別，符合低致病性禽流感病毒的分子特征［6－7］(表2)?；贘L株與GenBank中的H9亞型禽流感毒株分群參考毒株、國內(nèi)常用疫苗株以及近年來流行毒株的HA基因核苷酸序列，利用MEGA5.2軟件繪制系統(tǒng)進化樹(圖2)。遺傳進化分析結(jié)果表明，JL株屬于4.2.5分支，與RZ853株的親緣關(guān)系最近，與GX55、LG1等近年來流行毒株處于同一進化分支;而國內(nèi)常用疫苗株F、SS、SD696與BJ94株同屬4.2.3分支。分離的JL株所處的4.2.5分支和SS株等常用疫苗株所處的4.2.3分支同屬4.2這一大分支，但兩個分支之間有一定的遺傳距離［8－9］。

圖2 分離株的HA基因的系統(tǒng)進化樹

表2 JL株與各參考毒株HA蛋白關(guān)鍵位點的比較

2.5 HA基因和蛋白序列相似性分析 利用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件對JL株HA基因核苷酸、蛋白氨基酸序列與GenBank上獲得毒株的相應序列進行相似性比較。結(jié)果表明，JL株HA基因核苷酸序列、蛋白氨基酸序列與RZ853株等國內(nèi)近年流行的4.2.5分支H9亞型禽流感病毒的相似性較高，分別為90.9% ～97%和94.3% ～99.5%，而與國內(nèi)常用疫苗株 F、SS、SD696 等 4.2.3 分支毒株的相似性較低，分別為88.4% ～89.6%和90.7% ～91.4%。由此可見，同屬4.2 分支的 4.2.5分支(JL株等流行株為代表)和4.2.3分支(SS、F株等常用疫苗株為代表)之間存在了一定的差異。

3 討論

3.1 JL株的分離鑒定 本試驗從發(fā)病雞群中分離到JL株，它對雞紅細胞有血凝性，而凝集可被H9亞型禽流感病毒標準陽性血清所抑制，測序結(jié)果分析顯示，JL株的HA蛋白裂解位點的氨基酸序列為RSSR↓GLF，符合低致病性毒株的分子特征，證明JL株為H9亞型禽流感病毒低致病力毒株。

3.2 HA基因分析 裂解位點、受體結(jié)合位點和抗原位點都位于血凝素HA蛋白中，選用HA基因來分析H9亞型禽流感病毒的致病性、宿主特異性、抗原性以及遺傳變異等情況，可得到較為可靠的分析結(jié)果。受體結(jié)合位點方面，JL株及近年來的流行株HA蛋白的第226位氨基酸均發(fā)生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突變，呈現(xiàn)出典型的人流感病毒受體結(jié)合特性，這提示H9亞型禽流感病毒不經(jīng)中間宿主適應就能直接感染人類的趨勢更明顯，在未來可能對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大威脅［10］。至于潛在糖基化位點，JL株相比 F、SS等疫苗株發(fā)生了 S145N、T220I、P315S等突變，導致缺少 218NRT、增加了145NGT、313NGT潛在糖基化位點。145NGT的出現(xiàn)造成病毒不與抗H9N2的單克隆抗體F6、2A4發(fā)生反應，直接導致病毒致病性和抗原性的改變［11］;但其它兩個突變對于抗原性有多大影響，目前尚未清晰?；贘L株HA基因序列的系統(tǒng)進化樹表明，JL株屬于4.2.5分支，而國內(nèi)常用疫苗株F株、SS株、SD696株與BJ94株同屬4.2.3分支，JL株所處的4.2.5分支和疫苗株所處的4.2.3分支雖然同屬4.2這一大分支，但兩個分支之間有較明顯的遺傳距離和差異。本次分離的JL株和當前的流行株類似，均與疫苗株有一定的核苷酸、氨基酸序列以及抗原性差異，當前使用的疫苗株不一定能夠提供100%的完全保護。

3.3 H9的防控 當前一些肉雞場有H9亞型禽流感的暴發(fā)和流行，不能夠完全歸結(jié)為毒株變異、抗原性改變而使現(xiàn)有的疫苗不能完全保護，在多數(shù)情況下可能還與飼養(yǎng)環(huán)境、管理水平、免疫失誤等原因有關(guān)。畢竟商品肉雞生長周期短，免疫器官發(fā)育尚未成熟，接種滅活疫苗并未能迅速產(chǎn)生有效保護力，加上滅活疫苗主要誘導機體產(chǎn)生循環(huán)抗體，免疫雞群可能缺乏足夠的分泌型抗體，從而對粘膜的保護效果較低。如果飼養(yǎng)環(huán)境差，病原復雜，管理水平低，應激因素多，均會加重疫情。因此，要結(jié)合隔離、消毒等生物安全措施以及規(guī)范飼養(yǎng)管理來綜合防治，并適當結(jié)合應用有效的優(yōu)質(zhì)滅活苗(含有4.2.5分支毒株)進行補免，這有可能減少H9亞型禽流感的發(fā)生，或者降低其危害。

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