武 岳，周金龍，張超林，張?jiān)S科，*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002;2.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽471003)

豬傳染性胃腸炎(Porcinetransmissible gastroenteritis，TGE)是豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)引起豬的一種嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水等主要臨床癥狀的高度接觸性傳染病，各種年齡的豬對(duì)該病均易感，其中2周齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達(dá)100%，是威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病毒性疾?。?］。近年來，該病有進(jìn)一步流行的趨勢(shì)，尤其是冬季和早春寒冷季節(jié)常呈地方性暴發(fā)流行。且該病的臨床癥狀和流行病學(xué)與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)、豬 輪 狀 病 毒(Porcine Rotavirus，PRV)、豬呼吸道冠狀病毒(Porcine respiratory coronavirus，PRCV)引起的疾病非常相似，傳統(tǒng)的血清學(xué)方法很難將其區(qū)分，這就大大增加了臨床診斷的難度，因此建立相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法勢(shì)在必行。

TGEV主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，其中S蛋白攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白。因此，S基因是TGEV基因工程疫苗研究的重要候選基因，S基因所表達(dá)的蛋白在決定病毒的親嗜性、致病性和血凝性等方面起著非常重要的作用［2－5］。研究表明，S 蛋白含有 A、B、C、D 4 個(gè)抗原位點(diǎn)［6］，在S蛋白的4個(gè)抗原位點(diǎn)中，A、B和D位點(diǎn)高度保守，A、D位點(diǎn)在誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生起著非常重要的作用［7］。其中，D位點(diǎn)在病毒的增殖過程中也起到一定的作用。另外，PRCV在基因組結(jié)構(gòu)上與TGEV具有較高的同源性［8］，TGEV S基因A抗原位點(diǎn)是TGEV和PRCV的保守序列［9］，而D位點(diǎn)在PRCV中缺失，可用于這兩種疾病的鑒別診斷。因此，本研究選擇了TGEV S基因編碼A、D抗原位點(diǎn)的片段進(jìn)行了表達(dá)，以便為TGE診斷方法的建立提供物質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株及細(xì)胞 TGEV毒株(ATCC?VR－1740TM)、Sf9細(xì)胞由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存。

1.1.2 主要試劑 Bac－to－Bac?HBM －TOPO?Secreted Expression System kit、Cellfectin?II Reagent、Sf900 II SFM、HiPure Plasmid Miniprep Kit，Invitrogen公司;Viral Nucleic Acid Extraction kit，Geneaid;Reverse Transcriptase XL(AMV)、Prime STAR?HS DNA Polymerase，大連寶生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技有限公司;去糖基化酶PNGase F，NEB公司;DAB顯色試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;HRP標(biāo)記兔抗豬 IgG、FITC標(biāo)記兔抗豬IgG，Sigma公司;豬傳染性胃腸炎陽性血清，美國(guó)VMRD公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的TGEV全基因序列(登錄號(hào):EU074218)設(shè)計(jì)一對(duì)引物F和R。引物序列為:F:5’－ATGTCATTGAACACAACGGGT－3’;R:5’－TAAGCCACTAAGTAGC GTCCT－3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1056 bp。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 RT－PCR擴(kuò)增目的基因 提取 TGEV的RNA，利用引物 R進(jìn)行 cDNA的制備。然后以cDNA為模板擴(kuò)增S基因編碼A、D抗原位點(diǎn)的片段。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，根據(jù)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書回收目的片段。

1.2.3 重組 Bacmid的獲得 根據(jù)Bac－to－Bac?HBM－TOPO?Secreted Expression System kit操作說明書，將回收產(chǎn)物直接克隆到pFastBacHBM－TOPO載體中，菌液PCR初步鑒定正確后，提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pFast－S;然后將pFast－S轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)三重抗性(卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素)藍(lán)白斑篩選后，利用試劑盒中提供的pUC/M13引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，然后提取質(zhì)粒，將陽性重組質(zhì)粒命名為Bacmid－S。

1.2.4 重組桿狀病毒的制備、擴(kuò)增及鑒定 將獲得的重組質(zhì)粒Bacmid－S轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生明顯病變時(shí)，收集上清液，即為P1代重組桿狀病毒。然后根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行蝕斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定重組病毒滴度，按照MOI=0.1將P1代重組桿狀病毒［VML=(MOI×細(xì)胞總數(shù))/病毒滴度］接種到細(xì)胞密度為2×106/mL的Sf9細(xì)胞中，27℃培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)橹?，收集上清即為P2代毒。同樣的方法接種P2代毒，收集P3代毒，用于蛋白的表達(dá)。提取P3代重組病毒核酸，利用目的基因上下游引物F/R進(jìn)行重組病毒的PCR鑒定。

1.2.5 重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中的表達(dá) 將懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于重組病毒的表達(dá)。接種前進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×106/mL，按MOI=5接入P3代毒，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照，置于27℃的搖床中，110 r/min培養(yǎng)48～72 h，收集上清。

1.2.6 間接免疫熒光(IFA)鑒定表達(dá)產(chǎn)物 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將P3代重組桿狀病毒接種于預(yù)先長(zhǎng)滿單層的Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)至發(fā)生病變時(shí)用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，具體步驟為:吸去細(xì)胞上清，用 PBS 液(0.01 mol/L、pH 7.4)洗滌細(xì)胞3次，用80%丙酮固定細(xì)胞20 min;然后用PBS洗3次，加入豬傳染性胃腸炎陽性血清37℃孵育1 h;再用PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記兔抗豬IgG 37℃孵育50 min，最后用PBS洗3次置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.7 Western blot鑒定重組蛋白 將P3代重組病毒感染Sf9細(xì)胞，72 h后收集感染上清，同時(shí)收集正常Sf9細(xì)胞作為陰性對(duì)照進(jìn)行SDS－PAGE電泳，用半干電轉(zhuǎn)移法將PAGE凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜上，進(jìn)行Western blot鑒定。將轉(zhuǎn)印有蛋白的NC膜用封閉液4℃封閉過夜后，加入豬傳染性胃腸炎陽性血清(1∶200稀釋)37℃孵育1.5 h;PBST漂洗3次后，加入HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG(1∶2000稀釋)37℃孵育1 h;再用PBST漂洗3次后用DAB顯色試劑盒顯色2～3 min，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT－PCR擴(kuò)增目的基因 RT－PCR擴(kuò)增S基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到1056 bp左右的特異性條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。

2.2 重組Bacmid的鑒定 用pUC/M13引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在3556 bp處有一條電泳條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明重組Bacmid構(gòu)建成功(圖2)。

2.3 重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin?ⅡReagent介導(dǎo)下，將重組質(zhì)粒 Bacmid－S轉(zhuǎn)染融合至95%的Sf9昆蟲細(xì)胞，72 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞腫大，細(xì)胞核增大，折光性增強(qiáng)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞開始從底部脫落懸浮到培養(yǎng)基中(圖3A)，而正常Sf9細(xì)胞無此變化(圖3B)，表明重組病毒拯救成功。

圖1 S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 S基因重組Bacmid的PCR鑒定結(jié)果

圖3 重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞顯微觀察圖(200×)

2.4 RT－PCR鑒定重組病毒 提取P3代重組病毒的核酸，用目的基因上下游引物F/R進(jìn)行RTPCR鑒定，電泳條帶為1056 bp，與預(yù)期目的基因大小一致。

2.5 IFA鑒定重組蛋白的表達(dá) 經(jīng)IFA鑒定，感染Bacmid－S的Sf9細(xì)胞中具有明顯的特異性熒光(圖4A)，而Sf9對(duì)照細(xì)胞沒有熒光(圖4B)，結(jié)果表明S蛋白在Sf9細(xì)胞中得到了表達(dá)。

圖4 S蛋白的間接免疫熒光鑒定結(jié)果

2.6 Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物 轉(zhuǎn)印結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物在蛋白分子質(zhì)量約為55 kD左右出現(xiàn)了一條特異性條帶(圖5A)，表明S蛋白在昆蟲細(xì)胞中得到了表達(dá)。用去糖基化酶PNGase F處理重組蛋白后，Western blot結(jié)果顯示在43 kD左右處出現(xiàn)了與預(yù)期理論值大小相符的條帶(圖5B)，表明昆蟲細(xì)胞對(duì)其表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行了糖基化修飾。

3 討論

目前，用于蛋白表達(dá)的系統(tǒng)很多。大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工修飾，影響其在診斷試劑抗原和疫苗制備等方面的應(yīng)用。酵母表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠?qū)ν庠吹鞍啄苓M(jìn)行糖基化修飾，但具有局限性［10］。而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物可以進(jìn)行磷酸化、糖基化等一系列的翻譯后加工修飾［11］，另外桿狀病毒嚴(yán)格的宿主特異性，決定了它不能感染脊椎動(dòng)物細(xì)胞，因此重組桿狀病毒不會(huì)對(duì)人和環(huán)境造成危害［12］，對(duì)畜禽無致病性［13］，在疫苗生產(chǎn)藥物開發(fā)等方面具有更好的應(yīng)用前景［14］。所以，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成為研究者們首選的真核表達(dá)系統(tǒng)［15］。

本研究采用Bac－to－Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將含有A、D抗原位點(diǎn)的S基因片段直接克隆入pFastBacTMHBM－TOPO載體，經(jīng)轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)染后獲得重組桿狀病毒。與其它桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)如Bac－N－Blue系統(tǒng)相比，避免了重組病毒蝕斑篩選純化的步驟，大大縮短了重組病毒的產(chǎn)生周期。此外，pFastBacTMHBM－TOPO載體中含有蜂毒素信號(hào)肽序列，該序列為一分泌信號(hào)，保證了所表達(dá)的重組蛋白能夠有效的分泌到細(xì)胞外介質(zhì)中，這就增強(qiáng)了正確的二硫鍵的形成，同時(shí)降低了蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解，還可以顯著減少雜蛋白的水平，簡(jiǎn)化后期純化過程。

目的蛋白的表達(dá)水平除了受基因性質(zhì)的影響外［16］，還與轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)［17－18］。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類、用于表達(dá)的細(xì)胞種類、接種病毒時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度、接毒劑量以及收毒時(shí)間等均可影響目的蛋白表達(dá)量。對(duì)轉(zhuǎn)染條件及表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化可獲得穩(wěn)定高效的表達(dá)。本研究采用能夠生產(chǎn)高滴度病毒的Sf9昆蟲細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，為了產(chǎn)生高滴度的重組病毒，本試驗(yàn)選擇在250 mL或500 mL的三角瓶中懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，使懸浮細(xì)胞有更多的空間與病毒接觸，當(dāng)細(xì)胞活率大于95%時(shí)調(diào)整細(xì)胞密度到2.0×106～2.5×106/mL進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，接毒后細(xì)胞死亡率達(dá)到70% ～80%時(shí)收獲病毒液，發(fā)現(xiàn)此時(shí)收獲的病毒表達(dá)量最大。而且所表達(dá)的蛋白以可溶性的形式存在于感染細(xì)胞的上清中，為后期診斷抗原制備提供了方便和可行性。

Western blot顯示的條帶相對(duì)分子質(zhì)量(55 kD左右)比理論值(43 kD)偏大，經(jīng)糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，目的蛋白含有10個(gè)N－糖基化位點(diǎn)，19個(gè)O－糖基化位點(diǎn)，可能是昆蟲細(xì)胞對(duì)其表達(dá)的外源S蛋白進(jìn)行了糖基化修飾的結(jié)果［19－20］，因此增大了目的蛋白的分子量。本研究目的蛋白在昆蟲細(xì)胞中的成功表達(dá)，為TGE診斷抗原的研制及免疫預(yù)防的研究奠定了基礎(chǔ)。

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