許 欣 姚冬穎 趙振亞 李永才(邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科，河北 邢臺(tái) 05400)

腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移仍是大腸癌患者死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞間黏附的喪失是腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的第一步。上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)在組織結(jié)構(gòu)的形成和維持中發(fā)揮重要作用，同時(shí)E-cadherin必須與連接素形成復(fù)合物才能發(fā)揮作用，β-catenin是復(fù)合物功能起重要調(diào)控作用的因子，任何一種成分表達(dá)異常都導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，造成腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移增加?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9是MMPs中的水解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重要的蛋白水解酶，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究檢測(cè)大腸癌中E-cadherin、β-catenin、MMP-9的表達(dá)及其相關(guān)性，進(jìn)一步探討大腸癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科2010年1月至2011年12月期間手術(shù)切除大腸癌標(biāo)本110例，術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。男61例，女49例;年齡＜55歲32例，≥55歲78例;腫物位于結(jié)腸70例，位于直腸40例;腫瘤最大直徑＜4 cm者48例，＞4 cm者62例;高-中分化66例，低分化44例;浸潤(rùn)深度未侵及漿膜51例，侵及漿膜59例;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的57例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的53例;Dukes分期A+B期50例，C+D期60例。另取20例正常大腸黏膜(來(lái)自同期大腸腺癌手術(shù)切除距離腫瘤5 cm以上未受累的大腸腸殘端組織)作為對(duì)照。所有標(biāo)本均常規(guī)取材，10%中性緩沖福爾馬林液固定，石蠟包埋。每例選取有代表性的蠟塊做3μm厚連續(xù)切片，備做HE及免疫組化染色。

1.2 方法 采用免疫組化EnVision兩步法，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、鼠抗人β-catenin單克隆抗體、鼠抗人MMP-9單克隆抗體(均為工作液)及免疫組化試劑盒均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司。以試劑公司提供的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陽(yáng)性對(duì)照，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，每例都行HE切片作為對(duì)照觀察。

1.3 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野，每高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，以陽(yáng)性瘤細(xì)胞占全部瘤細(xì)胞的百分比判斷。E-cadherin和β-catenin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞膜呈棕黃色染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性(+)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性(-)〔1〕。MMP-9陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或核呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性(+)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性(-)〔2〕。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin、β-catenin、MMP-9在大腸癌及對(duì)照組的表達(dá)E-cadherin和β-catenin正常分布于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，染色呈棕黃色，胞質(zhì)及胞核不表達(dá)，而在大腸癌組織中瘤細(xì)胞染色與正常上皮細(xì)胞相似，表達(dá)降低，有時(shí)可見(jiàn)胞質(zhì)染色。E-cadherin和β-catenin在20例正常大腸黏膜上皮均呈強(qiáng)表達(dá)，陽(yáng)性率為100%，而在大腸癌中陽(yáng)性率為67.3%和62.7%，有顯著差異(P＜0.05)。MMP-9陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒，在20例正常大腸黏膜中僅有3例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率僅為15%，明顯低于結(jié)直腸癌(57.3%，P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 大腸癌中E-cadherin、β-catenin、MMP-9的表達(dá)及其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 E-cadherin、β-catenin的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、漿膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈負(fù)相關(guān);MMP-9的表達(dá)與漿膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)。見(jiàn)表1。

2.3 大腸癌中 E-cadherin、β-catenin、MMP-9表達(dá)的相關(guān)性E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)的74例中，MMP-9陰性表達(dá)者有37例，而MMP-9陽(yáng)性表達(dá)63例中，E-cadherin陰性表達(dá)者有26例，E-cadherin和MMP-9蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)(r=-0.211，P=0.027)。β-catenin陽(yáng)性表達(dá)的69例中，MMP-9陰性表達(dá)者有36例，而MMP-9陽(yáng)性表達(dá)63例中，β-catenin陰性表達(dá)者有33例，β-catenin和MMP-9蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)(r=-0.223，P=0.019)。

圖1 E-cadherin、β-catenin及MMP-9在中分化大腸癌組織中的表達(dá)(DAB，×400)

表1 E-cadherin、β-catenin、MMP-9 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)包含復(fù)雜步驟的過(guò)程，癌細(xì)胞需經(jīng)歷從原發(fā)灶脫落、細(xì)胞黏附于基質(zhì)、蛋白水解酶降解基質(zhì)等向周圍組織侵襲或進(jìn)入淋巴系統(tǒng)而進(jìn)一步向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。E-cadherin即E-鈣黏附分子是鈣依賴黏附素家族中的重要成員之一，廣泛分布于上皮細(xì)胞相連接的細(xì)胞膜上，它介導(dǎo)并維持上皮細(xì)胞之間的緊密連接及正常的細(xì)胞形態(tài)。E-cadherin與βcatenin形成介導(dǎo)同型細(xì)胞間黏附的E-cadherin/β-catenin復(fù)合體，在維持細(xì)胞極性和組織結(jié)構(gòu)完整性中起重要作用。β-catenin是環(huán)連蛋白重要成員，為一條由多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，它還參與Wnt信號(hào)通路，介導(dǎo)信號(hào)從胞膜至胞核的傳遞〔3〕。已有研究發(fā)現(xiàn)的E-cadherin和β-catenin的低表達(dá)與多種惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Aresu等〔4〕報(bào)道，E-cadherin和 β-catenin的低表達(dá)與大腸癌的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期密切相關(guān)，表明E-cadherin和β-catenin表達(dá)的降低至使其介導(dǎo)的瘤細(xì)胞間黏附功能下降，腫瘤細(xì)胞趨于離散，易于從原發(fā)部位脫落，侵犯到鄰近的組織，而后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin與β-catenin在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著低于正常組織，且其表達(dá)水平隨腫瘤分化的降低、浸潤(rùn)深度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生及臨床分期的進(jìn)展明顯降低，提示大腸癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移與E-cadherin和β-catenin表達(dá)的降低關(guān)系密切。

MMPs家族是一類依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，還可通過(guò)新生血管生成等促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散〔5〕。MMP-9是MMPs家族中的重要成員，又名明膠酶B，屬于Ⅳ型膠原酶，能降價(jià)天然的Ⅳ/Ⅴ膠原和明膠，與多種惡性腫瘤有著密切的聯(lián)系，在腫瘤細(xì)胞突破基底膜屏障而浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔6〕。Zhang等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在低分化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例中高表達(dá)。Bendardaf等〔8〕的研究也證實(shí)，MMP-9表達(dá)水平低的患者預(yù)后更好。本研究結(jié)果顯示，MMP-9在大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組正常黏膜，提示其參與了大腸癌的發(fā)生。進(jìn)一步研究與臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，MMP-9的表達(dá)與臨床分期、漿膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，說(shuō)明其與大腸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程有關(guān)。

E-cadherin、β-catenin和MMP-9在大腸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的相互關(guān)系尚不清楚。本研究相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，大腸癌中E-cadherin和MMP-9、β-catenin和 MMP-9的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)MMP-9的高表達(dá)抑制了E-cadherin和β-catenin的表達(dá)，降低了癌細(xì)胞相互間的黏附，促進(jìn)了癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。所以E-cadherin和β-catenin的低表達(dá)與MMP-9的高表達(dá)在大腸癌的發(fā)生和惡性生物學(xué)行為中關(guān)系密切。

綜上，本研究證實(shí)了 E-cadherin、β-catenin和 MMP-9在大腸癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。因此，聯(lián)合檢測(cè)E-cadherin、β-catenin和MMP-9在大腸癌中的表達(dá)情況，對(duì)預(yù)測(cè)的生物學(xué)行為，指導(dǎo)臨床有重要意義，可為基因治療提供新的靶點(diǎn)。

1 Banu Y?，Didem K，F(xiàn)evziye K，et al.Immunohistochemical study of E-cadherin and β-catenin expression in colorectal carcinomas〔J〕.Pol J Pathol，2011;62(1):19-24.

2 劉 剛，關(guān)英華，任曉強(qiáng)，等.輸尿管癌中MMP-9、uPA的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012;28(10):1086-90.

3 Keiyu Z，Guangtao W，Yirong W，et al.The potential involvemet of E-cadherin and β-catenin in Meningioma〔J〕.PLos One，2010;5(6):1-6.

4 Aresu L，Pregel P，Zanetti R，et al.E-cadherin and β-catenin expression in canine colorectal adenocarcinoma〔J〕.Res Vet Sci，2010;89(3):409-14.

5 Nutt JE，Durkan GC，Mellon JK，et al.Matrix metalloproteinases(MMPs)in bladder cancer:the induction of MMP9 by epidermal growth factor and its detection in urine〔J〕.BJU Int，2003;91(1):99-104.

6 李曉虹，吳秋婉，張志明.ECM1、MMP-9與胃癌的研究新進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2011;17(19):2923-5.

7 Zhang Y，Guan XY，Dong B，et al.Expression of MMP-9 and WAVE3 in colorectal cancer and its relationship to clinicopathological features〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2012;138(12):2035-44.

8 Bendardaf R，Buhmeida A，Hilska M，et al.MMP-9(gelatinase B)expression is associated with disease-free survival and disease-specific survival in colorectal cancer patients〔J〕.Cancer Invest，2010;28(1):38-43.