張美杰 李 穎 么曉軼 李桂玲 金 迪 張繼榮

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

動脈粥樣硬化(AS)是腦梗死最重要的病理基礎，而炎癥是導致AS發(fā)生的重要原因〔1，2〕。調節(jié)性T細胞(Treg)是一種具有免疫抑制功能的細胞，在維持機體免疫平衡中具有重要的作用。Treg細胞比例降低或功能喪失都將導致機體免疫平衡受到破壞，從而出現免疫炎性反應。Mallat等〔3〕認為，Treg可控制AS的發(fā)生和發(fā)展。目前關于Treg細胞在AS性腦梗死發(fā)病中的研究還很少。本研究擬探討AS性腦梗死患者外周血Treg比例及功能的變化情況。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年5月1日至2014年7月1日在我科住院的AS性腦梗死患者20例為研究組，選擇同期入院進行健康體檢者20例為對照組。研究組男11例，女9例;平均年齡(56.73±6.35)歲，均排除自身免疫性疾病、嚴重心肝腎功能不全和血液系統(tǒng)疾病等。對照組男10例，女10例;平均年齡(56.36±6.39)歲。AS性腦梗死患者根據美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)進行神經功能缺損評分(輕度:≤15分;中度:16～30分;重度:31～45分)。根據Pullicino公式(長×寬×CT或MRI掃描陽性層數/2)計數梗死灶體積(小梗死灶:＜5 cm3;中梗死灶:5～10 cm3;大梗死灶:＞10 cm3)。

1.2 主要試劑 Ficoll分離試劑購自GE Healthcare公司;APC-Foxp3購自Biolegend公司;Treg細胞和Na?ve CD4 T細胞分選磁珠購自美天旎公司;CFSE試劑購自Invitrogen公司。

1.3 外周血單個核細胞分離方法 所有患者于入院后次日清晨空腹采集外周靜脈血，經Ficoll分離獲取外周血單個核細胞(PBMC)，具體分離方法參見文獻〔4〕。

1.4 Treg細胞和Na?ve CD4 T細胞獲取方法 嚴格按照美天旎磁珠分選說明書分選獲取Treg細胞和Na?ve CD4 T細胞。

1.5 CFSE增殖檢測 無菌分選獲取的Na?ve CD4 T細胞，以10 ml的 RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌1次，隨后加入終濃度為5 mmol/L的CFSE染液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育10 min，隨后在細胞中加入5 ml預冷的CFSE染色終止液(含5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基)，冰上放置5 min，400 r/min離心8 min，再以10 ml的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌1次，細胞以RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸后，加入預先包被1μg/ml CD3抗體及2μg/mlCD 28抗體的48孔板中，孵育5 d后收取細胞進行流式細胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件行Anova分析方法或t檢驗。

2 結果

2.1 兩組外周血Treg細胞比例比較 對照組外周血Treg細胞比例為(11.38±2.54)%，明顯低于研究組〔(4.89±0.89)%〕(P＜0.01)。

2.2 研究組外周血Treg細胞與患者危險因素關系 研究組外周血Treg細胞比例與患者年齡、性別、高血壓、糖尿病和血脂異常均無明顯關系(P＞0.05)。見表1。

表1 研究組外周血Treg細胞與患者危險因素關系(±s)

表1 研究組外周血Treg細胞與患者危險因素關系(±s)

參數 n Treg細胞比例(%) P值＜65 12 4.87±1.19 ＞0.05≥65 8 4.39±1.13性別 男 10 4.55±1.22 ＞0.05女10 4.21±1.14高血壓 是 12 4.45±1.01 ＞0.05否8 4.65±1.25糖尿病 是 11 4.45±1.01 ＞0.05否9 4.11±1.73血脂異常 是 11 4.45±1.81 ＞0.05否年齡(歲)9 4.01±1.24

2.3 研究組外周血Treg細胞比例與患者病情相關性分析輕、失重度神經功能缺損患者外周血Treg細胞比例分別為(7.45±3.52)%、(4.22±1.36)%、(2.18±1.20)%，隨著神經功能缺損逐漸加重，患者外周血Treg細胞比例逐漸降低。小、中、大梗死灶患者外周血Treg細胞比例分別為(6.45±2.47)%、(4.15±1.79)%、(2.46±1.16)%，隨著梗死灶體積的逐漸加大，患者外周血Treg細胞比例逐漸降低。

2.4 外周血Treg細胞抑制CD4 T細胞增殖能力檢測 對照組外周血單獨Na?ve CD4 T細胞的增殖能力為(81.3±10.56)%，Na?ve CD4 T細胞與Treg細胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4 T細胞的增殖能力為(52.2±11.39)%。研究組外周血單獨Na?ve CD4 T細胞的增殖能力為(82.2±13.45)%，Na?ve CD4 T細胞與Treg細胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4 T細胞的增殖能力為(81.9±11.48)%。與對照相比，研究組外周血Treg細胞抑制外周血Na?ve CD4 T細胞增殖的能力顯著降低(P＜0.01)。

3 討論

AS是動脈硬化血管病中常見的最重要的一種，其特點是受累動脈病變從內膜開始。AS患者動脈壁上會沉積一層像小米粥樣的脂類，使動脈彈性減低、管腔變窄。AS發(fā)病過程一般是先有脂質和復合糖類積聚、出血及血栓形成，纖維組織增生及鈣質沉著，伴隨有動脈中層的逐漸蛻變和鈣化，病變常累及彈性及大中等肌性動脈，逐漸發(fā)展到阻塞動脈腔，則導致該動脈供應的組織或器官缺血或壞死。目前關于AS的發(fā)病機制主要有脂質浸潤學說、炎癥損害學說和內皮損傷學說等〔5～7〕，然而在這些學說中相似的是都認為炎癥在AS的發(fā)生和發(fā)展過程具有重要作用〔8，9〕。

Treg是一種具有免疫抑制功能的細胞，在維持機體免疫平衡中具有重要的作用。已知Treg細胞比例降低或功能喪失都將導致機體免疫平衡受到破壞，從而出現免疫炎性反應。動物實驗表明，調節(jié)Treg細胞的動態(tài)平衡，已成為當今治療動脈粥樣硬化性腦梗死的重要靶點〔10〕。國內外已有大量文獻報道，Treg細胞在急性心肌梗死后其外周血數量明顯減少〔11〕。而目前關于Treg細胞在AS性腦梗死患者外周血中的變化研究還很少。

本研究結果發(fā)現，AS性腦梗死患者外周血Treg細胞比例顯著降低，其外周血Treg細胞比例與患者發(fā)病危險因素均無明顯關系，而與患者神經功能缺損評分和梗死灶體積明顯相關，隨著神經功能缺損的逐漸加重和梗死灶體積的逐漸加大，外周血Treg細胞比例逐漸降低。提示AS性腦梗死患者外周血Treg細胞免疫抑制功能受損。綜述所述，本研究結果證實AS性腦梗死患者外周血Treg細胞比例明顯降低，功能也出現一定程度的喪失，導致免疫炎性反應發(fā)生，最終導致AS性腦梗死發(fā)病。

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4 胡良安，李岱容，羅永艾，等.CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)T細胞抑制肺結核患者特異細胞免疫〔J〕.基礎醫(yī)學與臨床，2012;32(2):182-5.

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