胡 衛(wèi) 陳 濤 王 泉 詹 玲 鞏仔鵬 余雪琴 錢京萍

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

珠子參為五加科植物珠子參〔Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Buck.)C.Y.Wu et K.M.Feng〕或羽葉三七〔Panax japonicus C.A.Mey.var bipinnatifidus(Seem.)C.Y.Wu et K.M.Feng〕的干燥根莖，具有活血散瘀，補血止血，消腫止痛之功〔1〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示珠子參對血液及造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤、心血管系統(tǒng)等均有一定的作用〔2〕。目前尚未見到珠子參抗衰老的相關(guān)報道，而同屬人參、竹節(jié)參提取物能直接清除自由基，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶的活性及降低丙二醛(MDA)含量，發(fā)揮抗衰老作用〔3，4〕。本研究觀察珠子參多糖對D-半乳糖(D-gal)致衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，從學(xué)習(xí)記憶能力、清除氧自由基能力等方面探尋其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品 珠子參購自宜昌市中醫(yī)醫(yī)院藥房，經(jīng)三峽大學(xué)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室汪鋆植教授鑒定。香菇菌多糖片(100 mg/片)為武漢迪奧藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號:20110701。

1.2 動物 SPF昆明鼠，雌性，體重(20±2)g，購自湖北省實驗動物中心，許可證號:SCXK(鄂)2008-0005。動物飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實驗動物中心，室溫(22±2)℃，濕度(60±5)%，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.3 儀器與試劑 MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);752紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);光學(xué)顯微鏡(廣州光學(xué)儀器廠);離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);D-gal(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:F20080429);MDA、SOD、總抗氧化能力(T-AOC)、CAT 和蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所);其余試劑均為市售分析純。

1.4 衰老模型的建立 在借鑒秦紅兵等〔5〕造模方法基礎(chǔ)上，進(jìn)行必要的改進(jìn)。實驗小鼠頸背部皮下注射 D-gal溶液(150 mg/kg，使用前用生理鹽水配成溶液)，空白對照組則皮下給予相同體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)6 w。

1.5 珠子參多糖的制備 珠子參根莖購買鑒定后，采用水提醇沉法提取珠子參粗多糖〔6〕，提取后的粗多糖保持干燥，使用前配置成50、100 mg/kg 2個劑量。

1.6 動物分組及給藥 將50只小鼠采用完全隨機(jī)設(shè)計分組法分為5組，即空白對照組(對照組)、D-gal致衰老模型組(模型組)、香菇多糖對照組(陽性組)、珠子參多糖低、高劑量組(珠子參DD組、珠子參DG組)，每組10只。珠子參多糖低、高劑量組給藥劑量分別為50、100 mg/kg;陽性組香菇多糖給藥劑量為100 mg/kg;對照組和模型組灌胃給予同等體積蒸餾水，每日1次。造模同時給藥，連續(xù)42 d，灌胃前2 h小鼠禁水禁食。

1.7 小鼠Morris水迷宮測試學(xué)習(xí)記憶能力實驗 Morris水迷宮是測量嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法〔7〕。儀器主要由一直徑為120 cm、高50 cm的圓形水池和一可移動位置的平臺組成，水池上空通過一攝像機(jī)與監(jiān)視器和計算機(jī)連接。水池里水溫控制在(22±0.5)℃，平臺、水、池壁均染成黑色以隱蔽平臺，水中不能明顯見到安全平臺。水池等分為4個象限，將平臺放在第三象限中間，在其他3個象限任選一點面向水池池壁將小鼠放入水中。實驗過程中水池及周圍環(huán)境保持不變。當(dāng)設(shè)定的訓(xùn)練時間已到或小鼠已爬到平臺，計算機(jī)停止跟蹤并記錄下游泳軌跡和自動計算出小鼠在水池中所游過的路程、時間及找到平臺所需的時間(即潛伏期)等。試驗第6周測試，分別進(jìn)行定位航行實驗和空間搜索實驗。

1.7.1 定位航行實驗 用于測量小鼠對水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的能力。實驗歷時5 d，每天分上、下午兩段，每段訓(xùn)練2次，每次2 min。每天訓(xùn)練時將小鼠面向池壁，分別從4個不同的入水點放入水中，記錄2 min內(nèi)尋找平臺所需時間(逃避潛伏期)。若小鼠入水后2 min內(nèi)未能找到平臺，則將其置于平臺上并停留10 s再放入水中，引導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶。

1.7.2 空間搜索實驗 用于測量小鼠對平臺空間位置記憶的能力。定位航行實驗后第2天實驗。實驗時撤去平臺，然后任選一個入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄每只小鼠在2 min內(nèi)第一次經(jīng)過原平臺的時間(潛伏期)，每只小鼠在2 min內(nèi)經(jīng)過平臺的次數(shù)以及在原平臺所在象限內(nèi)逗留的時間。

1.8 樣本處理和指標(biāo)檢測 組織勻漿制備:學(xué)習(xí)記憶能力測試實驗結(jié)束24 h后，將小鼠頸椎脫臼位處死，迅速取其肝臟和腦組織，剔去結(jié)締組織、稱量、勻漿器研磨后加預(yù)冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿。3 000 r/min離心10 min，取其上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。分別測定肝組織和腦組織的MDA含量和SOD活性，以及肝組織T-AOC、CAT活性。

2 結(jié)果

2.1 珠子參多糖對D-gal致衰老小鼠一般狀態(tài)影響 對照組小鼠行動活躍，反應(yīng)敏捷，毛色光滑，食量、飲水均正常;與之相比，模型組小鼠毛發(fā)干枯、無光澤，行動遲緩、自主活動明顯降低，食量、飲水略有減少;陽性組和珠子參多糖組小鼠各狀態(tài)均有明顯改善。

2.2 珠子參多糖對D-gal致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.2.1 定位航行實驗 隨著學(xué)習(xí)時間的延長，在5 d訓(xùn)練期間，各組小鼠逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而不斷縮短，表明各組小鼠通過訓(xùn)練對于尋找平臺均有一定的學(xué)習(xí)記憶能力，但表現(xiàn)出了一定的差別。訓(xùn)練的第1天，各組小鼠的平均逃避潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異。從第2天開始，模型組的平均逃避潛伏期雖有所降低，但與對照組相比明顯延長(P＜0.05)。而珠子參多糖組與模型組相比平均逃避潛伏期縮短，并且隨著時間的延長，差異的顯著性越來越明顯，尤以珠子參DG組更為顯著(P＜0.05，P＜0.01)。模型組潛伏期在5 d內(nèi)下降速度較慢，其進(jìn)步不明顯，說明造模小鼠記憶能力受到明顯損害，而香菇多糖、珠子參多糖對衰老小鼠的記憶能力有一定的保護(hù)作用。見表1。

2.2.2 空間搜索實驗 與對照組相比，模型組小鼠第1次達(dá)到原平臺的潛伏期延長，在原平臺所在象限內(nèi)逗留時間縮短，穿越原平臺次數(shù)減少(P＜0.05，P＜0.01)。而香菇多糖與珠子參DG組均能縮短第1次到達(dá)原平臺的潛伏期，延長在原平臺所在象限內(nèi)逗留時間，增加穿越原平臺次數(shù)(P＜0.05)。見表1。

2.3 珠子參多糖對D-gal致衰老小鼠肝、腦組織SOD活性和MDA含量的影響 與對照組相比，模型組肝和腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，而珠子參DG、DD量組小鼠肝臟和腦組織SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

2.4 珠子參多糖對D-gal致衰老小鼠肝組織T-AOC、CAT活性的影響 與對照組相比，模型組肝組織CAT活性明顯降低(P＜0.05);而珠子參DG、DD組小鼠肝組織T-AOC活性明顯升高(P＜0.05)，見表2。

表1 珠子參多糖對D-gal致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(x ± s，n=10)

表2 珠子參多糖對D-gal致衰老小鼠肝、腦組織SOD活力和MDA含量、肝組織T-AOC及CAT活性的影響(x ± s，n=10)

3 討論

D-gal衰老模型小鼠是研究藥物抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶能力的重要動物模型，因其具有造模時間短、操作簡便、模型易于建成、重復(fù)性好等特點，自1991年首次構(gòu)建后便得到了廣泛的運用〔8〕。近年來，植物多糖的抗衰老作用引起越來越多的關(guān)注。研究表明，紅景天多糖、香菇多糖等均具有良好的抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶的功能〔9～11〕。珠子參均為五加科人參屬植物，含總皂苷、多糖、揮發(fā)油和微量元素等多種成分，具有益氣活血，補血止血，消腫止痛之功。本課題組在前期珠子參抗腫瘤研究的過程中發(fā)現(xiàn)，珠子參具有良好的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和延長荷瘤小鼠生命、提高荷瘤小鼠免疫功能的功效〔12，13〕。傳統(tǒng)衰老學(xué)說認(rèn)為:氧自由基與細(xì)胞凋亡和衰老密切相關(guān)，它通過參與細(xì)胞凋亡對衰老進(jìn)程產(chǎn)生影響，減少氧自由基的產(chǎn)生，有延緩衰老的作用。因此我們進(jìn)行了珠子參抗衰老的初步研究，并發(fā)現(xiàn)珠子參多糖對D-gal所致的衰老小鼠具有良好的抗氧化的作用，用藥組肝臟和腦組織中SOD、T-AOC活性較模型組有明顯升高，而MDA含量顯著降低;且Morris水迷宮實驗顯示實驗組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力均有明顯的提高;證實珠子參多糖具有確切的抗衰老效果。后續(xù)擬進(jìn)一步研究其對衰老小鼠線粒體端粒酶及有關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，以期更深入闡明其抗衰老的可能機(jī)制。

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