連浩淼，李紹戊，張 輝*，盧彤巖

(1．東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030;2．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070)

冷水性魚類以鮭鱒魚類為代表的，只能在潔凈、清冷、無污染的流動水域中生長的名貴魚類的總稱。我國冷水性魚類約有88種(亞種)，其中可開發(fā)利用的經(jīng)濟(jì)品種較多，主要有大麻哈魚、鱘魚、鰉魚、河鱒、紅點(diǎn)鮭、哲羅鮭、細(xì)鱗鮭、虎嘉魚、黑龍江茴魚、雅羅魚、狗魚、大銀魚、裂腹魚類、重唇魚、江雪等 50 多種［1］。

我國冷水域開闊，這為我國冷水性魚類的養(yǎng)殖和生產(chǎn)提供環(huán)境優(yōu)勢。但隨著冷水魚養(yǎng)殖密度不斷增大，養(yǎng)殖技術(shù)欠缺及管理調(diào)控水平低，冷水魚病害問題愈加嚴(yán)重，給冷水魚養(yǎng)殖帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。密集養(yǎng)殖的情況下給魚類養(yǎng)殖環(huán)境造成壓力，長期密集養(yǎng)殖會造成免疫抑制和疾病暴發(fā)［2］，其中細(xì)菌性疾病成為冷水魚養(yǎng)殖中重要的病害之一。有研究曾報(bào)道常見細(xì)菌性疾病包括爛鰓、爛鰭、疥瘡、細(xì)菌性敗血癥、腸炎等，已有學(xué)者對一個(gè)地區(qū)冷水魚細(xì)菌病病原菌進(jìn)行研究［3］以及多個(gè)地區(qū)一種病原菌的分離研究［4］，2013年5—8月筆者于三北地區(qū)冷水魚養(yǎng)殖場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，對患病的虹鱒、大西洋鮭、銀鮭、西伯利亞鱘等進(jìn)行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，以期為三北地區(qū)冷水魚細(xì)菌病防控提供參考。

1 材料與方法

1．1 病魚癥狀及樣品采集

2013年5—8月，在遼寧本溪、牡丹江、青海、北京房山地區(qū)分別采集患病銀鮭魚、大西洋鮭、虹鱒、西伯利亞鱘，采集的具體信息見表1。

表1 2013年5月至2013年8月份采集樣品信息Tab．1 Information of fish sam ples collected in 2013．5—2013．8

1．2 培養(yǎng)基及主要試劑

實(shí)驗(yàn)用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)/胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)/腦心浸出液肉湯(BHI)/BHI瓊脂培養(yǎng)基/MH肉湯/Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基購于青島科技園海博生物技術(shù)有限公司;PCR所用試劑及特異性引物購自于上海生工生物工程有限公司;API 20NE、API 20E、API 20Strep試劑條購自于北京威泰科生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自于天根生化科技有限公司;革蘭染液、抗菌藥物藥敏紙片購于杭州天和微生物有限公司。

1．3 病原菌分離與接種

在無菌條件下從患病魚肝臟、脾臟、大腸處取樣劃線接種于培養(yǎng)基瓊脂平板上，28℃倒置培養(yǎng)24 h，分別挑取單個(gè)優(yōu)勢菌落在瓊脂平板上純化培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)的89株菌株。肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等，同時(shí)革蘭染色光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)特征;各項(xiàng)理化指標(biāo)的測定參照法國生物梅里埃公司API 20NE、API20E、API20 Strep試劑條進(jìn)行。挑取形態(tài)較好的單菌落接種于3mL肉湯培養(yǎng)基中28℃200 r/min震蕩12 h后取菌液和甘油4∶1的比例混合均勻，保存于-80℃冰箱備用。

1．4 16S rRNA基因序列測定

無菌條件下，將89株菌接種于TSB肉湯培養(yǎng)基中，28℃ 200 r/min震搖16 h后離心集菌，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA作為PCR模板DNA。利用細(xì)菌16S rRNA通用引物F27:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和 R1492:5′-GRTACCTTGTTACGACTT-3′對 89 株菌 16S rRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增［5］。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓120 V，電泳25 min，保存圖片用于查看分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1．5 藥敏試驗(yàn)

1．5．1 供試抗菌藥物 藥敏實(shí)驗(yàn)中測定了常見18種抗菌藥物:氨芐西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、環(huán)丙沙星 (ciprofloxacin)、恩諾沙星(enrofloxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、慶大霉素(gentamicin)、鏈霉素(streptomycin)、卡那霉素(kanamycin)、四環(huán)素(tetracycline)、紅霉素(erythromycin)、氯霉素(chloramphenicol)、復(fù)方新諾明(compound sulfamethoxazole)、呋喃唑酮(furazolidone)、利福平(rifampicin)、新霉素(neomycin)，以上藥敏紙片均購自于杭州天和微生物有限公司。

1．5．2 藥敏試驗(yàn)操作 藥敏試驗(yàn)采用K-B紙片法進(jìn)行。無菌條件下將89株菌挑入MH肉湯培養(yǎng)基中，28℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后將菌液濃度調(diào)至1．0×107CFU/mL。取0．1 mL培養(yǎng)菌液均勻涂布于9 cm的MH瓊脂平板上，然后等距離貼上藥敏紙片4片/平板，分別測定分離菌株對18種常見藥物的敏感程度。將貼合好的平板倒置于培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)24 h，測定其抑菌圈直徑(平行重復(fù)3次)，并根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判定［6］。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株分離鑒定結(jié)果

本研究從遼寧本溪分離病原菌13株，牡丹江分離病原菌32株，青海分離病原菌23株，北京房山分離病原菌21株，共分離菌株89株，并應(yīng)用API20試劑條對部分菌株進(jìn)行生化鑒定，菌株分離及生化鑒定信息見表2。

表2 部分菌株分離鑒定的相關(guān)信息Tab．2 Isolation and identification of part bacterial strains in this study

2．2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及比對結(jié)果

選取2013年5—8月采集分離病原菌的89株，采用PCR方法擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因，通過測序比對鑒定方法對其進(jìn)行初步鑒定。圖1為部分病原菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增后的電泳圖片。從圖中可以看出，擴(kuò)增片段大小約為1 500 bp，與目標(biāo)片段大小相同。對所得的16S rRNA片段進(jìn)行測序，將所得到的序列通過Genbank進(jìn)行比對分析，對所分離的病原菌得到初步鑒定結(jié)果。

圖1 16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig．1 Electrophoresis pattern of 16S rRNA PCR amplified products

2．3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

89株病原菌作為供試菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明相同地區(qū)同種菌株藥物敏感程度結(jié)果基本一致;不同地區(qū)相同菌株對藥物的敏感程度有差別;其中，氨芐西林除對青海地區(qū)黃桿菌、魯氏耶爾森菌，北京房山海豚鏈球菌抑菌外，對其他菌株不抑菌;阿莫西林除對青海黃桿菌，北京海豚鏈球菌和停乳鏈球菌抑菌外，對其他菌株均沒有抑菌作用。地區(qū)代表菌株的抑菌圈直徑見表3。

表3 部分菌株藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．3 Antimicrobial susceptibility test of parts of isolated bacteria in this study

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)了89株病原菌的藥物敏感比例，不存在菌株對慶大霉素、呋喃唑酮、阿莫西林和新霉素高度敏感，所有菌株對左氧氟沙星均敏感(表4)。

表4 89株菌的藥物敏感程度百分比Tab．4 The percentage of drug sensitivity to 89 strains

根據(jù)表4病原菌對抗生素敏感程度的統(tǒng)計(jì)，得出細(xì)菌耐藥比率分析圖(圖2)，菌株對不同種類抗生素耐藥的情況可以看出，供試的8個(gè)種類89株菌種中，有92．13%和96．63%的菌株分別對氨芐西林和阿莫西林具有很強(qiáng)的耐藥性，有100%、93．26%、91．10%、92．13%、91．01%和94．38%的菌株分別對左氧氟沙星、氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星敏感，其中對左氧氟沙星無耐藥菌株。

圖2 細(xì)菌耐藥所占比率Fig．2 The drug resistance percentage of isolated bacteria

3 結(jié)論與討論

2013年5—8月由于氣溫逐漸升高，是冷水魚細(xì)菌性疾病的多發(fā)時(shí)期。本研究從三北地區(qū)地區(qū)患病魚體的肝臟、腎臟、脾臟、腸道采集并分離得到了89株病原菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和理化特性試驗(yàn)并結(jié)合16S rRNA基因檢測對病原菌進(jìn)行了初步鑒定，分離到的菌種為殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、不動桿菌、黃桿菌、海豚鏈球菌及停乳鏈球菌，從遼寧本溪銀鮭與牡丹江大西洋鮭分離得到的病原菌多為殺鮭氣單胞菌，從青海虹鱒體內(nèi)分離得到的菌株多為溫和氣單胞菌和魯氏耶爾森菌，從北京房山西伯利亞鱘中分離到的菌株主要以停乳鏈球菌為主，已有學(xué)者對上述病原菌流行癥狀進(jìn)行研究。

殺鮭氣單胞菌分布地域廣，宿主范圍也很廣，是多種水產(chǎn)動物的原發(fā)性病原菌，可感染各個(gè)年齡段的海淡水魚類，每年對鮭鱒魚類造成十分嚴(yán)重的損失［7-8］，曹成易等［9］報(bào)道了殺鮭氣單胞菌能引起大西洋鮭體表潰爛;溫和氣單胞菌廣泛存在于水、土壤中，屬條件性致病菌，其主要的致病因子是產(chǎn)生各種溶血素和腸毒素，具有發(fā)病率高、感染快、傳播快、死亡快的特點(diǎn)［10-11］。劉敏等［12］報(bào)道了溫和氣單胞菌引起了鯉魚體表潰爛疾病;維氏氣單胞菌為人魚共患病致病菌，人食用了該細(xì)菌污染的水產(chǎn)品時(shí)，可引發(fā)腹瀉、腦膜炎和敗血癥等，免疫力低下的患者甚至能死于此菌的感染［13］。Sung等［14］報(bào)道了維氏氣單胞菌能引起對蝦體表嚴(yán)重出血、死亡的病癥;魯氏耶爾森菌為冷水性鮭鱒魚的常見病原菌［15-16］，幾乎對所有養(yǎng)殖的鮭鱒魚類都有感染性［17］。并且范方玲等［18］有過斑點(diǎn)叉尾鮰感染魯氏耶爾森菌引起體表及內(nèi)臟出血的報(bào)道;司力娜等［19］報(bào)道了嗜水氣單胞菌引起鯉魚敗血癥，目前嗜水氣單胞菌仍然是引起鯉鯽魚細(xì)菌性敗血癥的罪魁禍?zhǔn)?舍曉麗等［20］有過斑點(diǎn)叉尾鮰感染海豚鏈球菌的報(bào)道;顧天釗等［21］曾報(bào)道過鮑氏不動桿菌引起鱖魚肝臟嚴(yán)重病變至死亡;潘厚軍等［22］報(bào)道了停乳鏈球菌引起西伯利亞鱘魚內(nèi)臟出血及腹水等癥狀。根據(jù)有關(guān)報(bào)道這些病原菌已經(jīng)成為水產(chǎn)動物的致病菌，對水產(chǎn)的健康養(yǎng)殖帶來了嚴(yán)重危害。此次流行病學(xué)調(diào)查過程表明，每種病魚分別感染多種細(xì)菌而致病。

研究表明，不同地區(qū)的相同菌株API 20的鑒定結(jié)果有所差異，而造成這種差異的原因可能是地域環(huán)境差異等方面造成的，這與劉禮輝等［23］闡述的分離的柱狀黃桿菌有所差異是與地區(qū)、氣候、水質(zhì)條件及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件等方面的不同而產(chǎn)生的結(jié)果相似。16S rRNA序列法是一種現(xiàn)代的基于細(xì)菌遺傳特性的細(xì)菌鑒定方法［24］，并且也廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)細(xì)菌分子鑒定。本研究中不同地區(qū)相同菌株的16S rRNA結(jié)果基本一致，此結(jié)果驗(yàn)證了王荻等［25］的研究，不同地區(qū)的同種菌株保守區(qū)片段變化較小，同源性極高聚類不明顯，沒有形成明顯的區(qū)域性或特異性變化。

國內(nèi)對水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病的防治仍然依賴于抗生素。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離得到的89株菌株對氨芐西林和阿莫西林有較強(qiáng)的耐藥性，對左氧氟沙星、氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感，對鏈霉素、利福平、諾氟沙星、萘啶酸、四環(huán)素、呋喃唑酮、新霉素均有不同程度的耐藥，其中沒有菌株對左氧氟沙星耐藥，表現(xiàn)為最敏感。并且不同地區(qū)的相同病原菌對抗生素的敏感程度也有一定程度的差異。這也驗(yàn)證了林春友等［26］淡水養(yǎng)殖魚類病原菌藥敏試驗(yàn)中的結(jié)論，不同抗菌藥物對同一病原菌的MIC不同，同一抗菌藥物對不同病原菌的MIC也不同。青霉素類抗生素藥物對革蘭氏陽性菌較為敏感，而冷水魚中的病原菌以革蘭氏陰性菌為主，因此表現(xiàn)為不敏感。除了左氧氟沙星以外其他種類抗生素都有不同程度的耐藥情況出現(xiàn)，這樣高耐藥情況提示在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中不能盲目使用抗生素藥物，要對癥下藥，并且科學(xué)控制單次用藥的時(shí)間和劑量，避免再次用藥的高耐藥情況，在用藥的同時(shí)，做好飼養(yǎng)過程的調(diào)控和消毒工作，并且保持飼料的新鮮度，以及積極進(jìn)行冷水魚細(xì)菌性疾病疫苗的研發(fā)，這樣更能達(dá)到防治細(xì)菌性疾病的目的。本研究通過對三北地區(qū)冷水魚常見病原菌分離鑒定，表明不同地區(qū)同種菌株有共同特性同時(shí)也存在著差異，結(jié)合耐藥性研究結(jié)果，以期對三北地區(qū)冷水魚疾病防治以及實(shí)現(xiàn)冷水魚健康養(yǎng)殖提供參考。

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