劉德春，王敏力，楊 莉，曾 瓊，劉山蓓，劉 勇

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

表皮蠟質(zhì)層是覆蓋在植物器官表面的一層保護性組織，具有防止表皮失水、抵御生物和非生物脅迫等生理功能。植物表皮蠟質(zhì)主要由特長鏈(C20-C36)飽和脂肪酸及其衍生物(包括烴、醛、酮、醇、脂等)、萜類物質(zhì)和其他微量次級代謝物(固醇及類黃酮類等)組成。不同種類植物表皮蠟質(zhì)含量和化學(xué)成分組成不同，并且同一種植物在不同的生長環(huán)境中，表皮蠟質(zhì)組成也不同［1］。

和其它植物一樣，柑橘果皮也覆蓋著一層蠟質(zhì)，具有重要的生理功能。在柑橘果實采收處理的過程中，打蠟是關(guān)鍵一環(huán)，可以增加果實光澤度，提高貯藏性能。但機械打蠟帶來的柑橘低溫貯藏過程中產(chǎn)生異味、品質(zhì)下降以及消費者關(guān)于食品安全的擔(dān)憂始終是難以解決的問題［2］。如果能選育出自身蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分改變的柑橘新品種，將可能解決這個難題。

2006年，本課題組在江西省信豐縣發(fā)現(xiàn)一株紐荷爾臍橙枝條變異，連續(xù)7年來觀察該枝條變異遺傳穩(wěn)定，主要特點是果實表皮極富光澤，因此被命名為“紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體”［3］。前期研究表明，與紐荷爾臍橙相比，該突變體果皮蠟質(zhì)晶體數(shù)目顯著減少，蠟質(zhì)成分中的烷和醛含量顯著下降［3］，突變體果實比對照具有更好的外觀品質(zhì)［4］;在4℃冷藏過程中，果實失重率和MDA含量突變體一直高于對照和打蠟?zāi)毘?，且前?99 d前)突變體臍橙腐爛率低于對照，但后期腐爛較快，突變體果實可溶性固形物、可滴定酸、可溶性總糖、Vc含量普遍高于對照和打蠟?zāi)毘龋f明突變體具有較好的臍橙果實貯藏品質(zhì)［5］。

本研究選擇不同發(fā)育時期的紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體母樹果實(突變體)、突變體臍橙枝條異地高接子一代果實為研究材料。對其不同發(fā)育時期的果皮蠟質(zhì)含量和成分進行比較分析，以鑒定突變體臍橙蠟質(zhì)成分的變化是否為基因變異導(dǎo)致的芽變，為紐荷爾臍橙果皮光澤型新品種的選育提供參考，并為進一步研究突變體形成的分子機理提供有用的信息。

1 材料與方法

1．1 材料

紐荷爾臍橙(Citrus sinensis［L．］Osbeck cv．Newhall)果皮光澤型突變體母樹果實(突變體)、突變體臍橙枝條異地高接子一代果實(子一代)分別于2012年7月28日、9月28日、11月28日在江西省信豐縣臍橙園采樣。母樹突變體臍橙從變異枝條東西南北四個方位，每個方位采集2個健康、無病蟲害果實，每個發(fā)育時期采集8個果實;子一代臍橙隨機選擇3棵長勢良好的果樹，從東西南北四個方位，每個方位采集2個健康、無病蟲害果實，每個種類每個發(fā)育時期果實共采摘24個，當(dāng)天運回實驗室進行下一步處理。

1．2 果實角質(zhì)膜蠟質(zhì)成分提取(酶解法)與測定方法(GC-MS)

用游標(biāo)卡尺測定果實橫縱徑，再用蒸餾水清洗，置于玻璃板上晾干。用內(nèi)徑為1．1 cm的打孔器在果實赤道部位均勻取4個孔。獲得的小圓片，用刀片仔細切除白皮層，放入20 mL玻璃試管中。加入10 mL EB酶解液(內(nèi)含0．1 mol/L的醋酸鈉、1 mmoL的疊氮化鈉、1%的果膠酶、1%的纖維素酶，用冰醋酸將pH調(diào)至3．8)，在37℃條件下震蕩培養(yǎng)48 h，中間換EB酶液一次，換液時注意剝離角質(zhì)和細胞壁成分。棄去酶液，用10 mmol/L的十水四硼酸鈉緩沖液清洗，除去依附于角質(zhì)上的細胞壁雜質(zhì)。再用DDW水清洗分離后的角質(zhì)膜，清洗標(biāo)準(zhǔn):上表面光滑，緊挨著細胞壁的表面平滑，沒有任何雜質(zhì)。將清洗干凈的角質(zhì)膜放入25 mL的血清瓶中，在60℃條件下烘48 h［6］。

向裝有樣品的玻璃瓶內(nèi)加入50μL(0．2 mg/μL)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)正二十四烷烴，在通風(fēng)廚內(nèi)晾干;加入2 mL氯仿，抽提1min;吸取200～500μL抽提液到反應(yīng)瓶;氮氣吹干至少于200μL;轉(zhuǎn)到反應(yīng)瓶，繼續(xù)吹干至少或等于100μL;在每一個反應(yīng)瓶中加入20μL硅烷化試劑(BSTFA)，在溫度為70℃的烘箱中衍生40 min;轉(zhuǎn)到上樣瓶中上樣分析。

GC-MS條件:采用通用型hp-5MS毛細管柱(30 m×0．25 mm×0．25μm)，固定相為聚二甲基硅氧烷。色譜條件為:進樣口溫度280，質(zhì)譜源溫度230℃，柱流速2 mL/min，恒定流速;Aux-2溫度280℃，載氣為氦氣，無分流注樣，進樣量1μL。質(zhì)譜條件為:電子轟擊電離方式，能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～600 amu，全掃描方式，溶劑延遲3 min。升溫過程為50℃保持1 min，以20℃/min升溫至170℃，保持2 min;再以5℃/min升溫至300℃，保持8min。各種蠟質(zhì)成分經(jīng)GC-MS檢測后得到其離子峰，依據(jù)質(zhì)譜庫進行檢索判定并按一定的條件對離子峰進行面積積分。

1．3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003辦公軟件對數(shù)據(jù)進行整理與分析，用SigmaPlot 10．0作圖。利用DPS軟件中的Duncan新復(fù)極差法作多重比較分析。其中顯著性差異水平:顯著(P＜0．05);極顯著(P＜0．01)。

2 結(jié)果與分析

2．1 突變體臍橙與突變體臍橙子一代果實發(fā)育過程中各蠟質(zhì)種類含量變化

突變體果實和子一代果實發(fā)育期間果皮各蠟質(zhì)種類含量變化情況見表1、圖1。試驗分離鑒定出的蠟質(zhì)組分主要有脂肪酸、烷烴、醇、三萜類化合物、小分子代謝產(chǎn)物和酯類。

7月采集的樣品中，突變體臍橙果實表皮中蠟質(zhì)含量從高到低依次為:脂肪酸、三萜類化合物、烷烴、小分子代謝產(chǎn)物、醇、酯類。其中脂肪酸含量最高為1．362 1μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為62．623 4%;酯類物質(zhì)含量最低為0．036 1μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為1．657 5%。子一代臍橙果實表皮蠟質(zhì)含量從高到低依次為:脂肪酸、三萜類化合物、小分子代謝產(chǎn)物、烷烴、醇、酯類。其中脂肪酸含量最高為0．693 1 μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為42．691 3%;酯類物質(zhì)含量最低為0．027 1 μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為1．669 6%。突變體臍橙果實表皮的蠟質(zhì)總量略高于子一代臍橙表皮蠟質(zhì)總量，但差異不顯著，并且突變體和子一代果皮除烷烴外各種蠟質(zhì)種類含量都不存在顯著差異。

表1 果實發(fā)育期間各蠟質(zhì)種類含量的變化Tab．1 Change of each wax fraction amount during fruit development

圖1 果實發(fā)育期間各蠟質(zhì)組分所占百分比Fig．1 Change of the percentage of each wax composition during the fruit development

9月采集的樣品中，突變體臍橙果實表皮中蠟質(zhì)含量從高到低依次為:脂肪酸、三萜類化合物、小分子代謝產(chǎn)物、醇、烷烴、酯類。其中脂肪酸含量最高為3．157 5μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為52．755 2%;酯類的含量最低為0．042 3μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為0．706 9%。子一代臍橙果實表皮蠟質(zhì)含量從高到低依次為:脂肪酸、三萜類化合物、小分子代謝產(chǎn)物、烷烴、醇、酯類。其中脂肪酸含量最高為2．901 5 μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為49．410 6%;酯類含量最低為0．027 5 μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為0．468 3%。9月中突變體和子一代臍橙果皮蠟質(zhì)總量不存在顯著差異，各種蠟質(zhì)種類含量也不存在顯著差異。

11月中，突變體臍橙果實表皮中蠟質(zhì)含量從高到低依次為:脂肪酸、三萜類化合物、小分子代謝產(chǎn)物、烷烴、酯類、醇。其中脂肪酸含量最高為7．413 9μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為72．104 9%;醇的含量最低為0．086 7μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為0．842 8%。子一代臍橙果實表皮蠟質(zhì)含量從高到低依次為:脂肪酸、三萜類化合物、小分子代謝產(chǎn)物、醇、烷烴、酯類。其中脂肪酸含量最高為6．138 6μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為63．021 0%;酯類物質(zhì)含量最低為0．096 0μg/cm2，占蠟質(zhì)總量的比例為0．985 7%。突變體臍橙中蠟質(zhì)總量為10．282 1μg/cm2略高于子一代臍橙9．740 6μg/cm2，但兩者差異未達到顯著水平。突變體臍橙與子一代臍橙脂肪酸、烷烴、醇類物質(zhì)、三萜類物質(zhì)、酯類等蠟質(zhì)種類含量差異均未達到顯著水平，但小分子代謝產(chǎn)物含量存在顯著差異。

隨突變體和子一代果實的生長發(fā)育，脂肪酸含量逐漸增加(表1)。突變體臍橙脂肪酸含量從1．362 1 μg/cm2增加至7．413 9 μg/cm2，子一代臍橙脂肪酸含量也逐漸升高，最低為0．693 1 μg/cm2，最高為6．138 6 μg/cm2;突變體臍橙烷烴含量逐漸下降，最高為0．178 0 μg/cm2，最低為0．112 3 μg/cm2。子一代臍橙烷烴含量先上升后下降，9月最高為0．176 0μg/cm2，7月份含量最低為0．138 9μg/cm2;突變體臍橙和子一代臍橙在果實發(fā)育過程中醇類物質(zhì)無顯著性差異;突變體臍橙三萜類化合物含量持續(xù)上升，7月份最低為0．322 6μg/cm2，11月份最高為1．534 5μg/cm2。子一代三萜類化合物含量先迅速上升，后緩慢下降，最低為0．355 6μg/cm2，峰值為1．695 9μg/cm2;突變體臍橙小分子代謝產(chǎn)物含量7—9月份上升迅速，9—11月份呈緩慢上升趨勢，最低含量為0．143 5μg/cm2，最高含量為1．045 4μg/cm2，子一代臍橙小分子代謝產(chǎn)物含量持續(xù)上升，最低為0．321 4μg/cm2，最高為1．607 0μg/cm2;突變體臍橙和子一代臍橙酯類物質(zhì)含量7—9月份緩慢上升，9—11月份上升迅速。突變體臍橙蠟質(zhì)總量逐漸上升，由2．175 1μg/cm2上升至10．282 1μg/cm2，子一代臍橙蠟質(zhì)總量變化趨勢與突變體臍橙一致，由1．623 6μg/cm2上升至9．740 6μg/cm2。如圖1所示，脂肪酸含量所占百分比突變體和子一代均是11月份最高，突變體為72．104 9%，子一代為63．021 0%。烷烴含量在中蠟質(zhì)成分中所占百分比均呈逐漸下降的趨勢。醇類含量所占比例在突變體臍橙和子一代臍橙果實表皮中呈下降趨勢，7月份、9月份和11月份在突變體臍橙和子一代臍橙中不存在顯著差異。三萜類化合物含量所占比例呈先上升后下降趨勢，其在子一代臍橙果實表皮中所占比例更大。小分子代謝產(chǎn)物含量在子一代臍橙果皮中所占比例更大。酯類物質(zhì)含量所占比例隨著果實的生長發(fā)育先下降后上升。

2．2 突變體臍橙與突變體臍橙子一代果實發(fā)育過程中各蠟質(zhì)成分含量變化

如圖2所示，為果實發(fā)育過程中突變體臍橙和子一代臍橙果實表皮的蠟質(zhì)成分。通過酶解法，共分離鑒定出 22 種蠟質(zhì)成分。分別為 C16、C17、C18、C20、C24、C28，C32、C33、C34的飽和脂肪酸和 C18∶2、C18∶1、C29∶5的不飽和脂肪酸;C27、C29、C31烷烴;C26∶1 和 C32∶1 的不飽和醇;β-香樹精，軟木三萜酮，β-谷甾醇，6甲氧基黃酮，單甘酯。

圖2 果實發(fā)育期間(7—11月)蠟質(zhì)成分的變化Fig．2 Change of theWax composition during the fruit development(from July to November)

7月樣品中，突變體臍橙和子一代臍橙果皮含量有差異的有8種，分別為C16、C17、C18∶2、C18、C24和C28脂肪酸，C27烷烴以及C32∶1醇。突變體臍橙和子一代臍橙均是C16脂肪酸含量最高，突變體中C16脂肪酸含量為0．828 6μg/cm2，子一代為0．306 6μg/cm2，突變體顯著高于子一代。此期間，變異和對照均未檢測出C29烷烴和C30∶6烷烴，β-谷甾醇、β香樹素、6甲氧基黃酮，軟木三萜酮、單甘酯等成分均不存在顯著差異。

9月中，突變體臍橙和子一代臍橙成分含量有顯著差異的有3種，分別是C24、C28脂肪酸，C27烷烴。突變體臍橙和子一代臍橙均是C16脂肪酸含量最高，突變體中為1．339 3μg/cm2，子一代為1．481 8μg/cm2，突變體含量略低于子一代，但兩者不存在顯著差異。

果實成熟期(11月)，突變體臍橙與子一代臍橙果皮蠟質(zhì)差異成分主要有10種，分別為C18∶2、C29∶5不飽和脂肪酸、C20、C24、C28、C32、C34飽和脂肪酸、β-谷甾醇、β-香樹精和 6 甲氧基黃酮。其中突變體臍橙中含量較高的為C18:2不飽和脂肪酸。子一代臍橙中含量較高的為C18∶2不飽和脂肪酸、C29烷烴、β-谷甾醇、軟木三萜酮。另外13種蠟質(zhì)成分雖然兩者在含量上存在差異，但是差異都不顯著。它們分別是分別為 C16、C17、C18、C33的飽和脂肪酸和 C18∶1 不飽和脂肪酸;C27、C29、C30、C31烷烴;C26∶1 和 C32∶1 的不飽和醇;軟木三萜酮;單甘酯。

3 結(jié)論與討論

迄今，人們已研究了很多柑橘品種的果皮蠟質(zhì)成分，GC-MS技術(shù)也廣泛應(yīng)用在柑橘果皮精油成分研究［7］。通過GC-MS結(jié)果分析，大部分柑橘果實中，烷烴、醛、醇和脂肪酸都是主要的蠟質(zhì)成分，但不同的柑橘品種和栽培環(huán)境的差異對蠟質(zhì)組分影響很大［8-9］。例如，Sala等［10］研究表明，生長在西班牙巴倫西亞的奈維林娜臍橙和溫州蜜柑的果皮蠟質(zhì)成分中，醛類、烷烴和脂肪酸含量較高，初級醇和萜類物質(zhì)含量較少，并且溫州蜜柑果皮蠟質(zhì)含量顯著低于奈維林娜臍橙;而同樣來自瓦倫西亞的富貴橘果皮蠟質(zhì)主要成分由多到少依次為烷烴、脂類、酮類、醛類、脂肪酸、初級醇、萜類［11］。與前人的研究結(jié)果類似，本研究采用酶解法從紐荷爾果皮光澤型突變體及其高接子一代臍橙果皮中也分離出了脂肪酸、烷烴、醇類、三萜類化合物、小分子代謝產(chǎn)物、酯類等蠟質(zhì)成分，但各蠟質(zhì)種類的含量與前人研究有差異，這可能是由于品種和栽培環(huán)境的差異造成的。

果實的生長發(fā)育過程中，無論是突變體臍橙還是突變體臍橙子一代，其蠟質(zhì)總量都是不斷增加的。果實生長發(fā)育過程中各組分在總蠟質(zhì)成分中所占比例也不斷變化。這些結(jié)果表明，果實生長發(fā)育過程中，在持續(xù)不間斷的分泌蠟質(zhì)，單位面積的蠟質(zhì)含量一致不斷累積，但單位表面積各蠟質(zhì)組分含量的增加速度不一致。和本文的研究結(jié)果一致，Sala等［10］研究也表明，生長在西班牙巴倫西亞的奈維林娜臍橙和溫州蜜柑果皮蠟質(zhì)總量隨著果實的發(fā)育也不斷增加。

本研究的主要目的是鑒定突變體臍橙與其高接子代果皮蠟質(zhì)組成的差異。結(jié)果表明在3個發(fā)育時期，突變體和子一代的果皮蠟質(zhì)總量差異不顯著，并且除烷烴和小分子代謝產(chǎn)物外，脂肪酸、醇、三萜類化合物和酯類均差異不顯著，所有的蠟質(zhì)成分均不存在極顯著差異。表明突變體與其高接子代的蠟質(zhì)主要差異成分不顯著。但是，對于某些單獨的蠟質(zhì)成分，如11月成熟期的C18∶2、C29∶5不飽和脂肪酸、C20、C24、C28、C32、C34飽和脂肪酸、β-谷甾醇、β-香樹精和 6 甲氧基黃酮，突變體和子一代存在較大的差異。突變體和子一代各個時期的差異成分，除C24和C28脂肪酸是在7月、9月、11月3個時期均存在顯著差異，在7月和9月均存在顯著差異為C24、C28脂肪酸和C27烷烴，在7月和11月均存在顯著差異為C18∶2、C24和C28脂肪酸，其他成分差異均只在單個月份發(fā)生。由于柑橘果皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成成分與柑橘種類、栽培環(huán)境、相對空氣濕度、樹體部位、果實不同的成熟度、樹齡等有密切相關(guān)［9-13］。因此這些差異很可能由突變體母樹與嫁接子一代樹齡和栽培環(huán)境及管理措施的差異導(dǎo)致的。果實成熟過程中，糖類物質(zhì)在有色層和果肉不斷積累，酸類物質(zhì)不斷降解，氨基酸逐漸增加，多種代謝物在不同組織中變化各不相同，具有較強的組織特異性和階段特異性［14］。因此，果實發(fā)育過程中單獨時期的蠟質(zhì)成分含量差異可能是由于階段特異性和組織特異性所導(dǎo)致。

本研究表明，突變體異地高接子一代臍橙果皮具有和突變體相似的蠟質(zhì)組成，是一個由基因突變導(dǎo)致的穩(wěn)定遺傳的芽變品種。

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